Гены мутаторы и антимутаторы

Участие процессов репликации, репарации и рекомбинации ДНК в возникновении спонтанных мутаций прослеживается и при изучении генов мутаторов и антимутаторов, выявленных у различных про- и эукариот. Такие гены влияют на уровень общей мутабильности организма, определяющейся частотой мутаций отдельных генов. Наряду с этим существуют мутабильные гены, спонтанные мутации в которых возникают с высокой частотой.

У E. coli известно несколько генов-мутаторов, находящихся в различных участках хромосомы этой бактерии. Мутации в одних генах (mut S, mut L) увеличивают спонтанную мутабильность в 100 раз, в других (mut T, mut D, mut H) - в 1000-100000 раз. Механизм действия таких генов не ясен, однако известно, что они часто взаимодействуют с другими генами, связанными с процессами вегетативной репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Например, продукция гена mut T специфично распознает ошибочные спаривания А с Г, удаляя остатки гуанина из ДНК. Предполагается, что этот продукт препятствует включению пуриновых и нуклеозидтрифосфатов против пуринов во время репликации, тем самым снижая вероятность трансверсии АТГЦ, как правило, возникающих вследствие замены типа пурин-пурин, но не пиримидин-пиримидин при ошибочных спариваниях в процессе репликации или репарации ДНК.

Кроме генов mut коррекция ошибочно спаренных оснований осуществляется у E. coli продуктом гена dam, являющимся ДНК-аденинметилазой. Этот фермент метилирует аденин в положении N⁶ в последовательности ГАТЦ. Мутации в гене dam обладают плейотропным действием: они повышают темп спонтанного мутирования, вероятность спонтанной индукции профага , увеличивают частоту рекомбинации. Это означает, что метилирование аденина также представляет важное звено в репарации ошибочно спаренных оснований, поскольку позволяет отличить родительскую цепь ДНК от вновь синтезированной цепи, в которой могут появиться основания, не спариваемые с соответствующими им основаниями в противоположной родительской цепи.

Примером генов-антимутаторов служит ген рх у фага Т4, продукт которого участвует в репарации и рекомбинации фаговой ДНК. Противоположным - мутаторным либо антимутаторным действием могут обладать различные аллели одного и того же гена, например гена 43 фага Т4, кодирующего ДНК-полимеразу, играющую основную роль в отборе оснований в процессе репликации фаговой ДНК.

Несколько генов с мутаторной и антимутаторной активностью обнаружено и у дрожжей.

Таким образом, генетическая стабильность большинства генов определяется не только особенностями их строения, но и уровнем общей мутабильности клетки, контролируемой генами-мутаторами и антимутаторами.

Мигрирующие генетические элементы (мгэ) и их роль в возникновении спонтанных мутаций. Мутабильные гены.

МГЭ у кукурузы

Некоторые гены спонтанно мутируют с очень высокой частотой

(порядка 10^-2-10^-3). Существование нестабильных, или мутабильных, генов отражает явление автономной мутабильности. Впервые такие гены были описаны Р. Эмерсоном у кукурузы (1914), а затем и М. Демерецем у цветковых растений (1931), а затем и дрозофилы (1941).

Природа нестабильности генов была открыта в исследованиях Б. Мак Клинток на кукурузе в 1947г. Она впервые указала на то, что структурные гены могут быть снабжены регуляторными элементами, которые у кукурузы представлены элементами Ds и Aс. Первый, названный диссоциатором, является локусом, в котором происходят разрывы (диссоциация) хромосом, приводящие к нарушению упорядоченного расположения генов. Подобные разрывы в локусе Ds образуются лишь в присутствии второго локуса - Ас (активатор). Показано, что локус Ас способен перемещаться (транспозироваться) в другие участки той же самой либо иной хромосомы. Локус Ds также может транспозироваться, но находится в зависимости от Ас. Мак Клинток обнаружила, что перемещение Ds из исходного сайта в ген C, детерминирующий продукцию фактора, необходимого для синтеза пурпурного пигмента в алейроновом слое зерна кукурузы, обуславливает два типа мутаций: стабильные и нестабильные. Первые возникли в отсутствие Ас и вели к образованию зеленых растений с бесцветными зернами. В присутствии Ас в некоторых клетках мутация в гене С, возникшая вследствие вставки локуса Ds, с высокой частотой ревертировала, что приводило к появлению пигментированных пятен на самом растении и на зернах початков. Генетический анализ показал, что реверсии - результат вырезания локуса Ds из гена С.

Наряду с элементом Ас у кукурузы обнаружен генетически идентичный ему элемент Мр, контролирующий возникновение нестабильных мутаций в гене Р, кодирующем синтез оранжево-красного пигмента, окрашивающего самый наружный слой зерна кукурузы - перикарп. Встраиваясь в ген Р, а затем перемещаясь из него с высокой частотой, элемент Мр, подобно Ас, вызывает нестабильное изменение признака, детерминируемого данным геном. Установлено, что локусы-активаторы Мр и Ас транспозируются в интерфазе клеточного цикла. Исследования элемента Мр показали, что его транспозиция происходит в момент, когда сам Мр уже отреплицировался, но репликация всей хромосомы часто еще не завершена. Из двух дочерних копий элемента Мр перемещается только одна, причем чаще она встраивается в ближайший сайт на той же хромосоме. Если сайт-мешень к моменту встройки Мр еще не реплицировался, то при его последующем удвоении образуются дочерние хромосомы, в одной из которых содержатся две копии элемента Мр, в другой- лишь одна копия, причем в новом сайте. Если Мр встроится в уже отреплицировавшийся сайт, одна из дочерних хромосом лишается Мр, а другая будет иметь две его копии (одна из них локализована в новом сайте). Выход Мр из гена Р приводит к реверсии нестабильной мутации. В результате ген Р начинает нормально функционировать и синтезируется оранжево-красный пигмент.

Элементы Ас и Ds удалось выделить. Элемент Ас состоит примерно из 4500 п.н. и имеет на концах инвертированные относительно друг друга почти идентичные последовательности длиной 11 п.н. Концевые повторы - отличительный признак различных МГЭ, однако у большинства транспозонов - МГЭ, обнаруженных у микроорганизмов, эти повторы длиннее. По своей структуре и функции элемент Ас очень напоминает бактериальный транспозон устойчивости к ампициллину Tn3. Оба МГЭ содержат два гена - больший и меньший, кодирующие белки транспозазу и резольвазу. Первый фермент начинает процесс транспозиции, второй - завершает его.

Элементы Ds оказались не идентичны друг другу, но близки по структуре элементу Ас. Разница заключается в размере делеций в ДНК Ас, превращающих его в Ds. Один из Ds образовался путем делеции 194 нуклеотидов в большем из генов Ас. В результате делеции этот ген, кодирующий фермент транспозазу, оказывается неактивированным. В другом элементе Ds утрачен еще больший фрагмент Ас. В третьем Ds от Ас остались лишь одни концевые инвертированные повторы. Во всех трех случаях элементы Ds утратили способность мигрировать самостоятельно, однако они могут узнавать и перемещаться ферментами транспозиции, если в клетке одновременно находится полноценный элемент Ас. В геноме многих растений находится не менее 40 последовательностей, подобных концевым структурам элемента Ас, хотя полноценных элементов Ас относительно немного. Отношение между элементами Ас и Ds вполне специфично: в клетках, лишенных соответствующего активатора, диссоциатор стабильно присутствует в определенном сайте вблизи или внутри своего структурного гена, полностью или частично блокируя его активность. Возвращение утраченного локуса-активатора в клетку в результате скрещиваний придает диссоциатору способность к миграции. Ген, из которого элиминировался локус Ds, возобновляет свою активность. Потомство таких особей часто мозаично, поскольку в нем будут находиться клетки с фенотипом "ген выключен" и "ген включен". Мозаичность потомства может проявиться в отношении нескольких признаков.

В геноме кукурузы обнаружен и другой тип МГЭ, названный Spm-элементом (от англ. suppressor-mutator), или Enhancer (англ. - усилитель). Элемент Spm характеризуется циклически меняющейся активностью (т.е. он попеременно то "включен", то "выключен"), и поэтому его встройка в ген, кодирующий синтез пигмента, приводит к появлению мозаичных по окраске (пятнистых) зерен. Активность элемента Spm может приводить как к супрессии гена, в который он встроился, так и к образованию обратных мутаций или реверсий, рассматривающихся как спонтанные, а на самом деле связанных с особенностями функционирования встроенного МГЭ.

Система из двух МГЭ является особенностью кукурузы. Однако закономерности, выявленные для этого вида, характерны и для случаев нестабильности генов других организмов. К ним относятся: 1) способность МГЭ к спонтанным перемещениям внутри генома либо между геномами; 2) внезапность, скачкообразность изменения состояния гена, связанная со вставками либо утратой МГЭ; 3) специфичность набора изменений в ДНК, связанных с активностью МГЭ.

В силу относительной специфичности МГЭ обусловливают не только существование мутабильных генов, но и общий уровень спонтанной мутабильности организмов, играя роль перемещающихся мутаторов. Такие способные к транспозициям последовательности обнаружены также у дрожжей, нематод, дрозофилы, мышей. Из животных они наиболее детально изучены у дрозофилы.

МГЭ у дрозофилы

Как и у кукурузы, выявление МГЭ у дрозофилы было связано с обнаружением нестабильных спонтанных мутаций, ревертировавших к дикому типу либо образующих делеции. Прямые доказательства присутствия МГЭ у дрозофилы были получены в середине 70-х гг. в лабораториях Г.П. Георгиева и В.А. Гвоздева в СССР и Д. Хогнесса в США при изучении повторяющихся, рассеянных по разным хромосомам и активно трнскрибирующихся генов. Было установлено, что указанные гены по-разному локализованы в хромосомах различных линий и даже иногда у отдельных особей внутри одной линии, причем, несмотря на большое сходство расположения у родственных линий мух, до 30% этих генов не имеют определенной локализации. Такие "прыгающие", или "кочующие" генетические элементы названы мобильными диспиргированными генами (МДГ) или элементами copia (копия), gypsy (цыган), Beagle (по имени корабля "Бигль", на котором плавал Дарвин) и др. В геноме дрозофилы обнаружено 20 семейств МДГ по 10-150 копий каждого семейства на геном. Число членов в каждом семействе варьирует от 100 до 200. Следовательно, общее число МДГ в геноме близко к 1000 и на их долю приходится до 5% всего генетического материала.

Размеры МДГ варьируют от 5000 до 10000 п.н.. Все МДГ фланкированы (содержат на обоих концах) длинными прямыми концевыми повторами (ДКП) из 269-571 п.н.. Каждый ДКП завершается коротким инвертированным повтором (КИП), состоящим из 15-20 п.н.. КИП фланкированы короткими (4-5 п.н.) прямыми повторами, возникающими в результате дупликации участка ДНК в геноме, в который внедрился МДГ.

ДКП играет ключевую роль в перемещениях МДГ. В них есть все элементы, требующиеся для транскрипции входящих в состав МДГ одного-двух структурных генов, контролирующих транспозицию. В составе МДГ обнаружены ТАТА-блоки, служащие сигналами для начала транскрипции, а также последовательности, необходимые для полиаденилирования 3-конца РНК, транскрибирующейся с МДГ. Для МДГ характерно, что примерно 95% общего числа транскриптов кодируются одной цепью МДГ, а 5% - другой.

Детальное изучение структуры МДГ выявило их сходство с провирусами эндогенных ретровирусов, присутствующих в геномах разных видов и наиболее подробно исследованных у птиц и млекопитающих. Провирусы представляют собой встроившиеся в геном хозяина ДНК-копии РНК, служащей генетическим материалом ретровирусов. Синтез ДНК на матрице вирусной РНК обеспечивается кодируемой этой РНК обратной транскриптазой (РНК-зависимой ДНК-полимеразой). При синтезе ДНК-копии, или провирусной ДНК, и ее интеграции с хромосомой клетки-хозяина образуются поледовательности, аналогичные ДКП у МДГ. Подобно МДГ, провирусы ретровирусов с высокой частотой перемещаются в различные участки генома, где они представлены во многих копиях. Имеются данные о том, что МДГ способны превращаться в вирусоподобные частицы и что процесс обратной транскрипции обеспечивает перемещения МДГ путем их множественного копирования с последующей встройкой полученной ДНК-копии в хромосомы.

Помимо МДГ у дрозофил известны еще два типа МГЭ. Один из них, обозначаемый FB, присутствует примерно в 30 копиях на геном, имеет длину от 500 до 5000 п.н., фланкирован инвертированными повторами длиной 250-1250 п.н. и окружен в ДНК-мишени прямыми повторами длиной 9 п.н.. Другой МГЭ, названный Р-элементом, варьирует от 0 до 5 копий на геном (в зависимости от линии мух), имеет длину 500-2900 п.н. и фланкирован короткими инвертированными повторами длиной 31 п.н.

Как полагает Г.П. Георгиев, перемещение МГЭ играет определенную роль и в возникновнии спонтанных мутаций, ведущих к онкотрансформации клеток, т.е. к развитию злокачественных опухолей. Связано это с тем, что помимо образования мутаций вставка МГЭ может активировать функцию соседнего гена. Так, расположение ДКП с двух сторон МДГ может инициировать транскрипцию в обоих направлениях от него. В результате окаймляющие МДГ структурные гены хромосомы могут выйти из-под контроля клетки-хозяина и активно транскрибироваться. Если МДГ встроится рядом с одним из особых клеточных генов - онкогеном, кодирующим белки, необходимые для роста и размножения клеток, происходит резкая активация их транскрипционной активности и усиленный синтез указанных белков, переизбыток которых ведет к злокачественному перерождению клеток. Наряду с этим внедрение МГЭ внутрь онкогена может привести к изменению структуры его иРНК и, как следствие, к усиленной выработке белка на РНК-вой копии этого гена. Таким образом, существует по крайнем мере два механизма активации онкогенов за счет встройки МГЭ.

Частота транспозиции МГЭ, составляющая в среднем 10^-5 на поколение в некоторых случаях может значительно увеличиваться, причем в одной клетке одновременно может перемещаться несколько "прыгающих генов". Предполагается, что подобные "массовые перемещения" лежат в основе скачкообразных изменений генетического аппарата организмов в процессе эволюции, способствуя возникновению дупликаций соседних с МГЭ структурных генов.

Активация транспозиций МГЭ происходит при стессовых воздействиях на геном, приводящих к разрывам хромосом. Такие активированные МГЭ индуцируют различные мутации и хромосомные перестройки. Это означает, что даже небольшие повреждения ДНК могут усилить активность МГЭ и привести к "генетическим взрывам", являющимися важным источником изменчивости, включающим и выключающим гены либо усиливающим их экспрессию. Обусловленное перемещениями МГЭ "непостоянство генома" приводит к ненаправленной наследственной изменчивости организмов. Вместе с тем МГЭ - лишь один из факторов спонтанного мутагенеза, и их основная роль в эволюции связана с переносом чужеродных генов между разными организмами, в том числе и филогенетически отдаленными. Это второе свойство МГЭ более детально изучено у прокариот.