Специфичность и направленность индуцированного мутагенеза

Данные по химическому мутагенезу показывают, что процесс формирования мутаций многоступенчат и включает ряд стадий.

Вначале в немутантном гене в результате прямого или непрямого воздействия мутагена на ДНК возникает изменение, рассматриваемое как предмутационное (например, димер тимина и цитозина или алкилированное основание). Такое изменение может оказаться летальным или подвергнуться репарации. Это, в свою очередь, может восстановить нормальный ген либо привести к фиксации предмутационного повреждения и возникновению мутантного гена и соответственно мутантной клетки. В том случае, если клетка не гибнет, а сохраняет жизнеспособность, ее размножение ведет к образованию мутантного клона.

Тип мутаций определяет относительную специфичность этого процесса. В случае генных мутаций специфичность, как следует из приведенных в этом разделе примеров, проявляется в существовании “горячих точек” индуцированной мутабильности, характер распределения которых зависит от двух факторов - последовательности нуклеотидов в данном гене и использованного мутагена. Вырожденность генетического кода обусловливает возможность замены нуклеотидов в третьем положении кодона без замен аминокислот в полипептидной цепи. Наряду с этим появление новой аминокислоты в результате мутации может не отразиться на активности фермента. Несомненно, от особенностей реакции мутагена с теми или иными нуклеотидами или последовательностью нуклеотидов зависит, какие участки гена будут оставаться “холодными”, т.е. не претерпевать изменений, а какие - “горячими”, т.е. мутировать часто. В силу двух первых причин даже мутации в “горячих точках” могут быть “молчащими”, если они не проявляются фенотипически. С этим, в частности, связано то, что истинная частота мутаций в данном гене всегда выше частоты появления мутантов по контролируемому им признаку.

Специфичность мутагенеза в отношении типа возникающих хромосомных мутаций оценивается по частоте образования внутренних делеций, концевых нехваток, инверсий, дупликаций и транслокаций. Вместе с тем специфичность действия мутагена определяется и рядом других факторов, значимость которых зависит от типа мутагена, особенностей клеточных процессов, влияния окружающей среды. К ним относятся: влияние внехромосомных компонентов клетки (ядерной оболочки, хромосомного белка) на проникновение мутагена; локальные различия в структуре хромосом, облегчающие проникновение мутагенов к одним генам по сравнению с другими; характер репарации предмутационного повреждения, определяющий его дальнейшую судьбу; зависимость проявления мутаций от изменений структурных компонентов клетки (например, мембран или рибосом), особенностей генотипа клетки (например, наличие генов-мутаторов или антимутаторов); возможности для образования мутантного клона, в значительной степени зависимые от окружающей среды.

Проблема мутагенной специфичности лежит в основе представлений о направленном и ненаправленном мутагенезе. Стремление к индукции направленных мутаций, открывающих неограниченные возможности для переделки живой природы, определяло поиски мутагенов, способных специфично воздействовать на тот или иной ген и вызывать мутации по вызываемому признаку. Ни один из известных теперь мутагенов такой избирательной специфичностью не обладает. В какой-то мере исключение из этого общего правила составляет нитрозогуанидин, с помощью которого удается провести локализованный мутагенез у бактерий. Как отмечалось, этот мутаген вызывает у бактерий множественные мутации, возникающие преимущественно в зоне репликативной вилки. Поэтому среди обработанных нитрозогуанидином клеток можно отбирать особи, несущие мутацию в заданном районе хромосомы. Если такая мутация приводит к устойчивости к антибиотикам либо к реверсии к прототрофности, то клоны бактерий, обладающих мутантным фенотипом, легко отбирать на соответствующих селективных средах. При этом в отобранных мутантных штаммах часто обнаруживаются и дополнительные мутации в сцепленных генах.

Существенные сдвиги в решении проблемы направленного мутагенеза произошли в последние годы в связи с разработкой методов манипулирования с изолированными ДНК. Появилась возможность подвергать мутагенной обработке не весь геном in vivo, а его определенные фрагменты in vitro. Методы клонирования генов позволяют направленно получать мутации даже при использовании обычно неспецифических мутагенов, например гидроксиламина и его производных. С помощью химически синтезированных олигонуклеотидов можно конструировать мутантные гены, содержащие небольшие вставки, делеции либо желаемые замены нуклеотидов. Таким путем были получены мутантные гены, кодирующие синтез белков некоторых бактериофагов, тРНК у дрожжей и др.

Эти и другие методы создали широкие возможности для изучения различных структурных генов и регуляторных участков ДНК, исследования связи между определенной заменой аминокислот и нарушением их функции и для получения мутантных белков. Задача ближайшего будущего - использование методов направленной индукции мутаций для создания организмов с желаемыми признаками. Успех в решении этой важной в практическом отношении проблемы связан с будущим углубленным изучением генетического аппарата животных и растений на молекулярном уровне.