Индуцированный мутагенез

Открытие мутационного процесса в начале ХХ века положило начало всестороннему изучению причин и механизмов наследственной изменчивости как общебиологического явления, присущего всем живым организмам. Естественным было желание воздействовать на этот процесс для повышения его эффективности. Успеху искусственного получения мутаций способствовали три обстоятельства: 1) выявление мутагенного действия рентгеновских лучей на хромосомы половых клеток; 2) обнаружение систем, позволяющих отличить хромосомные мутации от повреждений митотического аппарата клеток либо каких-то компонентов цитоплазмы; 3) разработка методов количественного учета вновь возникающих мутаций.

Мутагенное действие ионизирующих излучений

Первая успешная попытка изменить наследственность под действием радиации была предпринята Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым (1925), облучавших дрожжи препаратом радия. Поскольку генетика дрожжей в то время была совершенно не изучена, авторы этой работы не смогли доказать, что в основе отобранных ими новых форм лежит индукция наследуемых мутаций. Однако вскоре Г. Меллер (1927) на дрозофиле, а затем Л. Стадлер (1928) на ячмене и кукурузе убедительно продемонстрировали мутагенное действие рентгеновского излучения. Этому способствовала разработка надежных методов выявления сцепленных с полом летальных мутаций, а также видимых мутаций и крупных делеций.

Для идентификации летальных мутаций Меллер вывел такую линию D. melanogaster, самки которой содержали одну нормальную, а другую мутантную Х-хромосому. Мутантную хромосому он обозначил символом CIB. Она представляет собой протяженную инверсию, блокирующую кроссинговер между Х-хромосомами (“запиратель кроссинговера”). Отсутствие кроссинговера, с одной стороны, сохраняет все особенности хромосомы CIB, а с другой - препятствует переходу гена, в котором индуцирована летальная мутация, в хромосому CIB. I - рецессивная летальная мутация, которая может проявиться практически только в гемизиготном состоянии. В - сигнальная мутация (полосковидные глаза), по которой опознают самок-носительниц хромосомы CIB. Меллер облучал рентгеновскими лучами нормальных самцов и скрещивал их с самками CIB. Половина самок, полученных от такого скрещивания, будет нести хромосому CIB, тогда как другая половина - нормальную Х-хромосому. Вторая Х-хромосома у всех самок - облученная Х-хромосома самца-родителя. Для получения потомства F₂ скрещивают самок CIB с нормальными самцами. В результате половина самцов F₂ получают хромосому CIB, а вторая половина - облученную Х-хромосому. Если эта хромосома содержит рецессивную летальную мутацию, то в F₂ вообще не будет самцов. Напротив, отсутствие летальной мутации приводит к появлению в F₂ потомства с соотношением самцов и самок 1:2. Таким образом, присутствие или отсутствие индуцированных облучением рецессивных, сцепленных с полом мутаций можно легко распознать по присутствию или отсутствию самцов в потомстве от второго скрещивания.

Другой разработанный Меллером метод (Меллер-5) позволяет учитывать как летальные, так и видимые мутации. Хромосома Меллер-5 (М5) не содержит летальных мутаций, и поэтому самки могут быть гомозиготны по этой хромосоме. Кроме того, хромосома М5 содержит две инверсии, которые более надежно, чем в случае CIB, запирают кроссинговер. В хромосоме М5 также имеется ряд сигнальных генов: y, sc, w^ap. В случае индукции в Х-хромосоме самцов рецессивных летальных мутаций в F₂ соотношение самок и самцов становится 2:1.

Учет рецессивных видимых мутаций, возникающих в Х-хромосоме самцов, проводится методом сцепленных Х-хромосом. Линия дрозофил с такими Х-хромосомами была получена Т. Морганом. Самки этой линии имеют сцепленные Х-хромосомы и дополнительно Y-хромосому. Обычно сцепленные Х-хромосомы в гомозиготном состоянии несут рецессивную аллель у (от англ. yellow - желтый). Благодаря этому все самки со сцепленными Х-хромосомами имеют желтое тело, тогда как самцы - нормальную серую окраску. Гаметы таких самок содержат либо две сцепленные Х-хромосомы, либо одну Y-хромосому. При оплодотворении их облученным самцом возникают следующие комбинации: ХХХ - нежизнеспособные “сверхсамки”, XY - самцы, получившие Y-хромосому от матери, а Х - от отца, XXY - самки со сцепленными Х-хромосомами, YY - леталь. Если в Х-хромосоме облученного отца возникает видимая мутация, ее легко выявить по появлению в F₁ самца с необычным признаком среди массы нормальных самцов, легко отличимых от самок по окраске тела.

Используя метод CIB, Меллер обнаружил, что рентгеновское облучение самцов стократно увеличивает частоту образования рецессивных летальных мутаций. С помощью методов сцепленных Х-хромосом и Меллер-5 было установлено, что рентгеновское облучение индуцирует не только летальные, но и видимые мутации, а также большие делеции. Вслед за работами Меллера на дрозофиле и Стадлера на ячмене и кукурузе, Н. В. Тимофеев-Ресовский, К. Циммер, Дж. Ли, М. Демерец, К. Штерн, А. С. Серебровский и другие исследователи начали интенсивное изучение мутагенного действия радиации на дрозофиле, различных растениях и микроорганизмах. Эти работы положили начало радиационной генетике.

Разработка методов количественной оценки мутаций, индуцированных рентгеновскими лучами, и выявление мутагенности их действия на разных объектах позволили понять общие черты мутационного процесса, вызванного облучением. Были установлены следующие факты: 1) действие ионизирующей радиации как мутагенного фактора имеет универсальный характер и проявляется на всех биологических объектах; 2) мутационный процесс, вызванный ионизирующим облучением, ненаправленный, т.е. может затрагивать любые признаки организма и носит статистический характер; 3) радиация индуцирует те же типы мутаций, которые возникают и при спонтанном мутагенезе.

К ионизирующим относятся рентгеновские, - и космические лучи. Рентгеновские лучи с длиной волны 0,1-1 нм обладают высокой энергией, позволяющей им проникнуть внутрь живых тканей. При этом энергия этих лучей и других типов ионизирующих излучений поглощается непосредственно компонентами клетки, с которыми они сталкиваются, в том числе молекулами ДНК.

Существенно, что дозирование излучения не учитывает фактора времени. Это означает, что одна и та же доза может быть получена при слабой интенсивности облучения в течение длительного времени либо путем кратковременного облучения с высокой интенсивностью.

Как было установлено с помощью методов количественного учета мутаций у дрозофилы, кривые “доза-эффект” для сцепленных с полом рецессивных леталей и видимых (морфологических) мутаций носят линейный характер. Это означает, что частота индуцированных генных мутаций пропорциональна дозе облучения. Своеобразие радиобиологических кривых зависимости эффекта от дозы - отсутствие порога и постепенное нарастание до насыщения начиная с самых малых доз. Такой характер кривых отражает не только усиление степени поражения с возрастанием дозы, но и увеличение вероятности поражения: даже самые малые дозы ионизирующей радиации могут привести к гибели клетки и возникновению летальных мутаций, но лишь у небольшого числа особей. Этот вывод имеет важное значение при оценке допустимых доз радиации и опасностей, связанных с облучением.

Линейный характер зависимости частоты генных мутаций от дозы указывает, что они образуются одномоментно, т.е. один акт ионизации, возникающий вдоль пути следования вторичных электронов, вызывает мутацию. В радиобиологии такой акт ионизации называют “ударом”. Теория “удара”, созданная в 20-х годах, вскоре была модифицирована и легла в основу теории “мишени”, согласно которой возникновение генных мутаций, мелких делеций и одиночных разрывов хромосом под действием ионизирующей радиации - следствие одиночных ударов, причем повреждение происходит непосредственно в том месте, где возникает первичная ионизация, а вся реакция протекает внутри определенного объема (“мишени”), т.е. в самом гене либо в непосредственной близости к нему. Частота указанных изменений линейно зависит от дозы и не зависит от ее мощности (т.е. количества радиации в единицу времени) и от жесткости излучения (определяемой длиной волны).

В отличие от генных мутаций и простых делеций частота обменных перестроек хромосом под действием рентгеновского и - облучения возрастает примерно пропорционально квадрату дозы. При этом одноударная кривая зависимости числа мутаций от дозы облучения меняется на S-образную, многоударную. Теория мишени объясняет это тем, что указанные виды облучения характеризуются низкой величиной линейного переноса энергии (т.е. плотности создаваемой ими вдоль треков движения луча). Поэтому акты ионизации вдоль треков редки и каждый из них не зависит от другого. Отсюда следует, что акт ионизации (один “удар”) достаточен для того, чтобы возникла генная мутация или один разрыв хромосомы, но для двух разрывов хромосомы, ведущих к хромосомным аберрациям, требуется два “удара”. Поскольку они возникают независимо, вероятность их попадания в одну хромосому является произведением вероятностей для каждого из них, что и составляет основу зависимости частоты хромосомных перестроек от квадрата дозы облучения. В отличие от рентгеновских и -лучей нейтроны и -частицы, характеризующиеся высоким значением линейного переноса энергии, дают плотную ионизацию в пределах одного трека. Вероятность возникновения двух разрывов хромосомы значительно увеличивается, поэтому кривые зависимости частоты хромосомных аберраций от дозы облучения соответствует кинетике первого порядка.

Теория мишени сыграла значительную роль в развитии радиационной генетики. Вместе с тем был получен ряд новых фактов, для объяснения которых одной этой теории оказалось недостаточно. Выяснилось, что радиационные повреждения генетического материала являются не прямыми, а лишь потенциальными источниками возникновения мутаций, поскольку процесс индуцированного мутагенеза непосредственно связан с метаболизмом поврежденной клетки, в которой действуют различные системы репарации, т.е. восстановления интактной структуры ДНК. С репарацией связан, в частности, не вполне объяснимый теорией мишени факт, заключающийся в том, что фракционирование дозы рентгеновского облучения уменьшает частоту хромосомных перестроек, но, как отмечалось выше, не влияет на образование генных мутаций и мелких делеций. Очевидно, что если одна и та же доза радиации дается не сразу, а в несколько приемов, то часть индуцированных облучением разрывов хромосом успеет отрепарироваться с восстановлением интактной структуры ДНК до того, как очередной акт ионизации приведет к возникновению новых одиночных разрывов. Это вызовет уменьшение числа множественных разрывов и, следовательно, снизит вероятность крупных перестроек хромосом.

Вторая группа фактов, не учитываемых теорией мишени, по крайней мере, в ее первоначальной форме, связано с возможностью не только прямого, но и непрямого действия радиации. Коррективы в теорию мишени пришлось внести после обнаружения того факта, что в присутствии воды рентгеновские лучи не только прямо “ударяют” по чувствительным к ним генетическим структурам, но и действуют на них косвенно за счет разложения воды - радиолиза. Этот процесс приводит к образованию реакционноспособных короткоживущих свободных радикалов - водорода Н и гидроксила ОН, объединяющихся с образованием воды, атомарного кислорода О₂ либо химически активной перекиси водорода Н₂О₂.

Поэтому облучение молекул-мишеней в присутствии соединений, способных взаимодействовать со свободными радикалами, защищает молекулы-мишени от непрямого действия радиации. К ним, в частности, относятся соединения серы, действующие как “ловушки” радикалов и различные антиоксиданты, обуславливающие восстановление радикалов.

Наиболее важный способ воздействия на радиационное повреждение биологических объектов - изменение парциального давления кислорода. Так называемый кислородный эффект носит универсальный характер в том смысле, что при низком парциальном давлении кислород действует как радиопротектор, т.е. снижает число повреждений, вызванных радиацией. Вместе с тем, если кислород присутствует в момент облучения, он служит радиосенсибилизатором, т.е. усиливает повреждающий и мутагенный эффект. Выбор между этими возможностями определяется влиянием кислорода на образование радикалов. Выявление роли радикалов в непрямом действии радиации придало точный физический смысл одному из основных положений теории мишени о том, что генетические эффекты могут индуцироваться процессами ионизации, как в самой хромосоме, так и в непосредственной близости от нее. Наконец, третья группа фактов, не укладывающихся в теорию мишени, показывает, что эффективность радиационного мутагенеза определяется не только дозой либо ее мощностью, не только условиями, в которых клетки или целые организмы подвергались облучению, но и их биологической чувствительностью к летальному и мутагенному действию ионизирующих излучений, поскольку для разных организмов она неодинакова. Так, одна и та же доза рентгеновских лучей индуцирует у мыши примерно в 10 раз больше мутаций, чем у дрозофилы, и почти в 100 раз больше, чем у бактерий. Из этих данных ясно, что видовые различия в чувствительности могут заметно варьировать. Отсюда следует, что частоту мутаций необходимо определять с учетом видовых различий организмов. Следует также иметь в виду, что скорость возникновения индуцированных мутаций зависит от чувствительности клеток на разных стадиях клеточного цикла.

Исследования аберраций хромосом, индуцированных ионизирующими излучениями, начавшиеся более 50 лет назад, позволили установить зависимость их образования от стадии митотического цикла, на которую приходится мутагенное воздействие. При облучении клеток растений и животных в фазе G₁ хромосома ведет себя как одна эффективная нить. Это значит, что единицей разрыва и обмена, являющихся цитогенетическими эффектами радиации, служит целая хромосома. Согласно унинемной модели, это утверждение равносильно тому, что единицей разрыва и обмена в конечном итоге служит одна молекула ДНК. Перестройки хромосом, образующиеся при облучении в фазе G₁, называются аберрациями хромосомного типа.

Иная картина наблюдается при действии ионизирующих излучений на клетки в постсинтетическом периоде (G₂). Здесь каждая хромосома представлена двумя хроматидами и каждая из хроматид выступает как независимая единица разрыва и обмена. Поэтому в фазе G₂ хромосома реагирует на облучение как структура, состоящая из двух эффективных нитей, а перестройки, возникающие в этой фазе, называются аберрациями хроматидного типа.

Казалось бы, в фазе синтеза ДНК в ответ на действие радиации должны формироваться как хромосомные (в еще не реплицировавшихся участках) аберрации, так и перестройки хроматидного типа (в участках хромосом, где прошла репликация). Было, однако, показано, что смена типа перестроек с хромосомного на хроматидный в действительности происходит за 1-2 ч до начала фазы S. Причины этого явления до конца не ясны.

При облучении клеток в конце фазы G₂ - начале профазы образуются перестройки своеобразной конфигурации, получившие название субхроматидных обменов, поскольку нить, соединяющая две расходящиеся в анафазе дочерние хромосомы (бывшие сестринские хроматиды), тоньше хроматиды. Установить истинную природу той или иной перестройки можно путем анализа ее репродукции в полиплоидизирующихся клетках, например в клетках высших растений, в которых веретено разрушено колхицином. Обычно в тетраплоидах наблюдается удвоение аберраций, индуцированных радиацией в диплоидных клетках. При этом хроматидные перестройки, в частности изохроматидные и межхромосомные асимметричные хроматидные обмены, превращаются в типичные аберрации хромосомного типа. Точно так же ведут себя и субхроматидные обмены. На этом основании Б.Н. Сидоров и Н.Н. Соколов (1964) высказали мысль, что субхроматидные обмены в действительности представляют собой хроматидные перестройки, морфологически незавершенные (т.е. в них не обособились фрагменты) вследствие компактизации хромосом в профазе.

Таким образом, для радиационного хромосомного мутагенеза характерно возникновение структурных мутаций в той стадии митотического цикла, на которой произошло облучение.

В отличие от радиации химические мутагены типа алкилирующих соединений не вызывают хромосомных аберраций в фазе G₁, хроматидных - в G₂ и субхроматидных - в G₂-профазе. Обязательное условие формирования аберраций, индуцированных алкилирующими агентами - репликация ДНК в поврежденных участках хромосом. Поэтому при действии алкилирующих соединений на синтетическую фазу цикла, образуются хроматидные аберрации. Если же эти мутагены повреждают клетки в фазе G₂, то аберрации хроматидного типа формируются в следующем митозе.

Детальный анализ механизмов мутагенеза этого типа, значительный вклад в изучение которого внесли советские генетики Н.П. Дубинин, Н.В. Лучник, Б.Н. Сидоров, Н.Н. Соколов, Н.И. Шапиро и др., позволили заключить, что процесс образования хромосомных аберраций складывается из нескольких этапов. Первый - первичное репарируемое молекулярное повреждение ДНК, возникающее под действием непосредственно мутагенного фактора либо его продуктов в клетке, например, при облучении свободных радикалов. Конечный этап - образование видимых под микроскопом разрывов и обменов хромосом.

В последние годы находит подтверждение высказанная независимо в конце 20-х гг. Дж. Беллингом и А.С. Серебровским мысль о том, что мишенями для формирования аберраций хромосом служат участки физиологических, т.е. нормально возникающих в клетке, межхромосомных и внутрихромосомных контактов. Частными случаями таких контактов являются петли, предшествующие образованию делеций, инверсий и кольцевых хромосом. Контакты на молекулярном уровне могут представлять собой взаимодействия повторяющихся нуклеотидных последовательностей, принадлежащих к одному семейству.

В заключение остановимся на превращении кольцевых хромосом, доля которых при некоторых мутагенных воздействиях, например при облучении клеток растений и млекопитающих в фазе G₁, довольно значительна. Судьба кольцевых хромосом, как центрических, так и ацентрических, зависит от сестринских хроматидных обменов (СХО), регулярно осуществляющихся в фазах S и G₂. Если СХО между палочковидными, обычными хромосомами не изменяют их форму, то аналогичный процесс между кольцевыми хромосомами может иметь различные последствия. В результате СХО кольцевые хромосомы могут превращаться в дицентрические кольца и палочковидные хромосомы, причем разрывы колец в последнем случае будут распределены по хромосоме случайно. Следовательно, в таких клетках при каждом разрыве кольца разные гены будут занимать положение, ближайшее к точке разрыва, и испытывать эффект положения.

Различия в чувствительности к радиации регистрируется не только на уровне организмов, но и отдельных типов клеток. Так, сперматозоиды дрозофилы намного чувствительней к мутагенному действию рентгеновских лучей, чем сперматогонии и особенно ооциты. Больше всего мутаций индуцируется в дробящихся яйцах. Эти различия, отмеченные и для многих других организмов, могут быть связаны с особенностями состояния ДНК (степень спирализации хромосом, плотность их упаковки в ядре и др.) и митотической активности клеток разных типов с неодинаковым содержанием воды в их протоплазме, влияющим на возникновение свободных радикалов и перекисей, с различиями в их репарационной способности.

Таким образом, индуцируемый радиацией мутагенез зависит от следующего: 1) дозы и характера облучения; 2) особенностей организма; 3) типа облученных клеток; 4) условий среды в момент облучения и после него; 5) физических особенностей разных видов ионизирующих облучений; 6) типа повреждений ДНК и 7) эффективности систем их репарации.

Несмотря на обилие данных, молекулярный механизм радиационного мутагенеза не вполне ясен. Известно, однако, что рентгеновское облучение приводит к разрыву водородных связей в двойной спирали ДНК, одно- и двухцепочечным разрывам ДНК, сшивкам между двумя цепями ДНК, между различными молекулами ДНК и между ДНК и белком. Двойные разрывы ДНК у прокариот преимущественно летальны. Недавние исследования, главным образом на E. coli, выявили три механизма репарации одноцепочечных разрывов, вызванных ионизирующим излучением. Различия между ними определяются временем, необходимым для устранения повреждения, которое колеблется в зависимости от типа репарации и условий среды обитания облученных клеток от 2 до 60 мин. Имеются данные и о возможности репарации разрывов обеих цепей ДНК, в осуществлении которой, как показано С.В. Шестаковым с сотрудниками, участвуют рекомбинационные механизмы.