Сплайсинг про – иРнк у эукариот

Сравнение структуры ДНК соответствующей ей иРНК у эукариот привело к открытию прерывистого строения генов. Оказалось, что гены эукариот состоят из экзонов – последовательностей нуклеотидов, представленных в иРНК, и интронов – последовательностей, отсутствующих в иРНК. Отсюда было сделано заключение, что процесс экспрессии генов у эукариот включает этап, которого нет у бактерий: ДНК детерминирует синтез копии РНК, соответствующей последовательностям генома, однако это еще только РНК – предшественник, или про – иРНК. Непосредственно для образования белка она не используется. Для того чтобы РНК – предшественник превратилась в транслирующую иРНК, она должна пройти созревание, или процессинг. Сначала из РНК – предшественника должны вырезаться последовательности, соответствующие интронным участкам ДНК. Отграничение интронных последовательностей от экзонных подчиняется «правилу Шамбона»: интрон начинается с пары ГУ, а заканчивается парой АГ. После вырезания интронов, оставшиеся последовательности РНК, соответствующие экзонам в ДНК, объединяются между собой с образованием зрелой иРНК. Этот процесс называют сплайсингом(сшиванием) иРНК. Сплайсинг приводит к тому, что, хотя порядок расположения триплетов в эукариотическом гене соответствует порядку расположения кодируемых ими аминокислот в белке, расстояние между триплетами внутри гена не совпадает с расстояниями между соответствующими аминокислотами в белке. В результате сплайсинга иРНК составляет по длине лишь 1/10 первоначального транскрипта.

Генетический код

Синтезированная иРНК транслируется в последовательность аминокислот, образующую полипептидный генный продукт и определяемую генетическимкодом, то есть системой записи наследственной информации в молекулах нуклеиновых кислот различных организмов путем определенного чередования последовательностей нуклеотидов. Поскольку генетический код читается по иРНК, он записывается с помощью четырех оснований РНК (А, Г, Ц, У).

Расшифровка заключенного в ДНК генетического кода – крупнейшее достижение биологии ХХ века, равное по значению открытию генетической роли ДНК и ее строения. Идея о том, что гены контролируют структуру образующихся в организме белков, была высказана еще в 1904 году английским врачом – биохимиком А. Гарродом, изучавшим некоторые врожденные нарушения обмена веществ у людей. Одно из таких нарушений – алкаптонурия. Эту болезнь легко распознать по характерному потемнению мочи на воздухе, связанному с появлением в ней гентизированой кислоты, или алкаптона, являющейся промежуточным продуктом деградации ароматических кислот – тирозина и фенилаланина. Гаррод, намного опередив свое время, сумел понять, что этот дефект связан с блокированием нормального пути метаболизма указанных аминокислот и наследуется в виде одиночного рецессивного гена. Таким образом, впервые была высказана мысль о том, что между генами и метаболическими реакциями организма существует взаимосвязь. Подобно работе Менделя, сделанные Гарродом наблюдения остались незамеченными, и их переоткрытие состоялось более чем через 30 лет, когда Г. Бидл и Э. Татум приступили к изучению биохимических мутаций у гриба нейроспоры Neurospora crassa. Этот гриб по способу питания – прототроф, способный расти на бедной среде, содержащей лишь неорганические соли, какой – либо сахар, например сахарозу, в качестве источника углерода и лишь один витамин (В₆или биотин). Остальные необходимые для жизнедеятельности метаболиты, включая аминокислоты, азотистые основания и витамины, нейроспора может синтезировать самостоятельно. Бидл и Татум предположили, что данный объект весьма подходит для изучения генетического контроля синтеза указанных метаболитов. С этой целью они облучали неполовые споры (конидии) нейроспоры рентгеновскими либо УФ–лучами, для того чтобы индуцировать мутации в ее ДНК. После проращивания таких мутагенезированных спор отбирались клетки, не способные развиваться на бедной, но нормально растущие на полноценной среде, содержащей все аминокислоты, пурины, пиримидины и витамины. Каждый из выделенных клонов – потомков одной мутантной клетки, нуждался в каком – либо одном из указанных веществ. Генетический анализ показал, что в отобранных клонах мутация каждый раз происходила только в одном гене. В связи с этим было сделано заключение: одна мутация приводит к потере одной метаболической активности и, следовательно, один ген кодирует один фермент. Несмотря на то, что позднее было доказано, что многие белки (например, гемоглобин или уже упоминавшаяся ДНК–зависимая РНК–полимераза) состоят из двух (или более) полипептидных цепей, каждая из которых кодируется отдельным геном, и, следовательно, более точной является формулаодин ген – одна полипептидная цепь, вывод Бидла и Татума (1941) заложил основу современной биохимической генетики.

После того как стало очевидным, что структура полипептидов определяется генами, необходимо было понять, каким образом последовательность из четырех азотистых оснований в ДНК детерминирует последовательность из 20 аминокислот, образующих первичную структуру полипептидов. Поскольку генетическая информация переписывается с ДНК на иРНК, ясно, что генетический код должен непосредственно связывать последовательности оснований в иРНК с аминокислотным составом белка. Единица генетической информации, определяющая, какая из аминокислот будет встраиваться в синтезирующую молекулу белка, получила название кодона. Для того чтобы 20 аминокислот могли включиться в белок в процессе трансляции иРНК, необходимо, чтобы она содержала, по крайней мере, 20 различных кодонов. Если кодон будет состоять из двух оснований, их сочетания могут образовать лишь 4или 16 кодонов, что явно недостаточно для кодирования 20 аминокислот. Однако если в кодон входят три нуклеотида, то они могут комбинироваться в 4или 64 сочетания, что более чем достаточно. Гипотеза о существовании кода, содержащего три нуклеотида в каждом кодоне, впервые была предложена физиком А. Гамовым, (1954) и экспериментально доказана Ф. Криком с сотрудниками (1961) в результате генетического анализа мутаций в локусе г II бактериофага Т4, индуцированных акридиновым красителем – профлавином. Мутагенное действие профлавина является следствием ошибок репликации, приводящих к вставке или удалению одной пары оснований в ДНК. Мутации в локусе г II фага Т4 приводят к тому, что образуемые на бактериальном газоне негативные колонии фага имеют заметно больший размер, чем те, что формируются фаговыми частицами дикого типа. Полученные г II мутанты Т4 в свою очередь обрабатывали профлавином для получения из них фенотипически нормальных ревертантов г, которые легко обнаружить по образованию среди крупных негативных колоний фага немногих мелких. Путем анализирующих обратных скрещиваний между мутантными фагами и ревертантами было выявлено, что все фаговое потомство имеет мутантный (крупный) фенотип. Отсюда был сделан вывод, что индуцированные профлавином ревертанты формируются не вследствие истинной, обратной мутации в исходном сайте, а в результате возникшей по соседствусупрессорной(подавляющей) мутации. Так, если исходная мутация представляет собой вставку или делецию одной пары нуклеотидов, то супрессорная мутация может обеспечить восстановление дикого фенотипа лишь в случае, если она соответственно является делецией или вставкой. Очевидно, что выпадение или добавление одной пары нуклеотидов в случае исходной мутации должно привести к сдвигу рамки считывания, то есть к изменению одного из трех возможных способов чтения нуклеотидных последовательностей в виде отдельных триплетов. Иными словами, такие одиночные мутации должны привести к смещению точки, от которой начинается разбивка генетической информации на кодоны. Образующаяся вправо об этой области супрессорная мутация восстановит за счет вставки или делеции правильную рамку считывания в последующей (дистальной) части данного гена. Если участок между прямой и супрессорной мутациями кодирует последовательность аминокислот в белке, несущественную для его функциональной активности, то сдвиг рамки считывания фенотипически окажется незамеченным. Именно это и происходит в случае супрессорных мутаций в г II области фага Т4: несмотря на то, что содержащие их фаги продолжают нести исходную мутацию, они характеризуются диким фенотипом. Крик с соавторами провели несколько циклов обработки таких псевдореверантов профлавином, и все индуцированные в результате такой обработки мутации были отнесены к «+» или «-» типу, если они соответственно приводили к появлению новой вставки или делеции. Если исходная мутация была «+»-типа (вставка), а супрессорная соответственно «-»-типа (делеция), то возврат к мутантному фенотипу при повторных обработках профлавином наблюдался в случае образования новой супрессорной мутации «+»-типа и т. д. Проведя подобную условную классификацию полученных исходных супрессоров 1-го, 2-го порядков и т. д. (в действительности было неизвестно, какая именно мутация, «+» или «-»-типа, является вставкой или делецией), Крик с соавторами скрещивали затем мутантные фаги и отбирали рекомбинанты с различными комбинациями мутаций «+» или «-»-типа. Оказалось, что если рекомбинант содержал две «+» или две «-»-мутации, его фенотип всегда был мутантным. Однако рекомбинанты с тремя однотипными мутациями часто имели фенотип дикого типа. Это означало, что восстановление нормальной рамки считывания в следующей за этими мутациями части гена происходило лишь в случае трех, но не меньшего числа вставок либо делеций пар оснований. На основе этих чисто генетических экспериментов было сделано важное заключение о том, что кодон действительно состоит из трех нуклеотидов, т.е., что генетический код является триплетным. В последующем этот вывод был полностью подтвержден биохимически при исследовании трансляции иРНК in vitro и особенно путем прямого сравнения последовательностей нуклеотидов в определенных генах и аминокислот в их белковых продуктах.

Вслед за доказательством триплетности кода он был детально исследован, в результате чего было установлено, какие кодоны соответствуют конкретным аминокислотам и каким образом осуществляется пунктуация кода. Ответы на эти вопросы были получены в работах М. Ниренберга, ДЖ. Маттен (1961) и С. Очоа с соавторами (1962), показавших возможность конструирования искусственных молекул РНК с известным составом нуклеотидов, способных направлять синтез полипептидов in vitro. Так было обнаружено, что РНК, образованная уридиновыми нуклеотидами, в которых основанием является урацил, направляет синтез полипептида, состоящего только из фенилаланина. Изменяя относительное содержание различных нуклеотидов, можно получить молекулы РНК с различной частотой встречаемости каждого из 64 (4) кодонов, образуемых этими нуклеотидами, и выявить взаимосвязь между нуклеотидным составом РНК и аминокислотным составом синтезируемых под контролем этих РНК полипептидов. Прямые корреляции этих двух показателей были получены в работах Г. Кораны, использовавшего в системе синтеза белка in vitro синтетические иРНК с точно известной последовательностью нуклеотидов. В результате этих и других работ был полностью расшифрован генетический код и доказано, что данные о способности отдельных кодонов детерминировать соответствующие аминокислоты в синтезирующихся полипептидах, полученные в системах in vivo и in vitro, полностью совпадают.

Общие свойства кодабыли выявлены генетическими методами путем изучения молекулярных закономерностей образования мутаций. Они сводятся к следующему:

1. Генетический код универсален (т.е. идентичен в основном для всех живых организмов);

2. Триплетен (т.е. каждая аминокислота кодируется тремя нуклеотидами);

3. Не перекрывается (т.е. соседние триплеты не имеют общих оснований);

4. Не содержит каких–либо разделительных знаков между отдельными триплетами (код без запятых);

5. Имеет линейный порядок считывания и характеризуется колинеарностью, то есть совпадением порядка расположения кодонов в иРНК с порядком кодируемых ими аминокислот в синтезирующемся белке;

6. Является вырожденным, или избыточным, так как все аминокислоты (за исключением метионина и триптофана) имеют более одного кодона;

7. Из трех нуклеотидов кодона преимущественное значение имеют два первых, третий может варьировать;

8. В среднем каждая аминокислота кодируется тремя триплетами;

9. Число кодонов для каждой аминокислоты (кроме аргинина) коррелирует с частотой ее встречаемости в белках;

10. Частота использования различных кодонов для включения одной и той же аминокислоты может быть видоспецифичной.

Для пунктуации генетической информации во время ее трансляции имеют значение пять кодонов. Кодоны АУГ и ГУГ называются инициирующими. Они определяют правильное начало синтеза генного продукта при трансляции иРНК. Эти кодоны располагаются на границе последовательностей иРНК, списываемых с регулярной и структурной частей гена. Они указывают точку, от которой начинается синтез полипептидной цепи, поскольку регуляторная часть гена не транслируется. Если те же кодоны располагаются в структурной части гена (за редким исключением, связанных с особенностями кода в митохондриях), они теряют свое инициирующее значение и направляют включение метионина или валина соответственно. Помимо двух инициирующих код содержит тритерминирующихилинонсенс(бессмысленных), кодона (УАА, УАГ и УГА), определяющих окончание синтеза полипептидной цепи.

Универсальность кода, установленного для E. сoli, продемонстрированная во многих случаях, свидетельствует о его раннем эволюционном происхождении, но эта универсальность не абсолютна. Известны следующие отклонения от правила универсальности кода, обнаруженные у эукариот:

1. В митохондриях различных видов организмов кодон УГА не является терминирующим, а подобно УГГ, кодирует триптофан;

2. Кодоны АГА и АГТ не кодируют аргинин, а служат терминаторами;

3. Наряду с АУГ инициирующими служат кодоны АУА и АУУ;

4. У млекопитающих кодоны АУА и АУГ, находясь в середине цепи иРНК, кодируют метионин, а не изолейцин, как АУА в обычном коде, а кодон АУУ, как и в обычном коде, кодирует изолейцин;

5. У дрожжей кодон ЦУА кодирует не лейцин, а треонин.

Отмеченные изменения кода в митохондриях имеют характер упрощения, генетически более примитивна, чем хромосомная ДНК. Известно, что ДНК митохондрий у разных организмов, несмотря на отличия в размерах, кодируют лишь около 10 белков.