Трансляция иРнк

Рибосомы

Биосинтез белка осуществляется путем трансляции иРНК рибосомами – структурами, локализованными у эукариот в цитоплазме, часто на разветвленной внутриклеточной мембранной сети, называемой эндоплазматическим ретикулумом. У прокариот рибосомы разбросаны по всей клетке. Рибосомы состоят примерно из 50 белков и 3–5 молекул рРНК, различающихся по молекулярной массе. Размер рибосом обычно обозначают в единицах Сведберга (S), отражающих скорость их осаждения при центрифугировании. Независимо от происхождения рибосомы состоят из двух субъединиц. У E.coli рибосомы имеют коэффициент седиментации 70S, а более крупные рибосомы эукариот– 80S.Поскольку в клетках как про-, так и эукариот число рибосом очень велико, геныrrn, кодирующие рРНК, представлены в ДНК во многих копиях. Так, уE.coliимеется по 5-10 копий таких генов, локализованных в трех различных районах хромосомы. У эукариот гены, кодирующие синтез рРНК, представлены в сотнях и даже тысячах копий и тандемно повторяются (т.е. расположены непосредственно друг за другом) в районе ядрышкового организатора определенных хромосом, либо сгруппированы в виде тандемных повторов в других участках генома.

Особенности и различия про- и эукариотических иРнк

Прокариотическая иРНК

Как отмечалось, многие прокариотические иРНК полицистронны, т.е. содержат последовательности, детерминирующие синтез нескольких полипептидов. Поэтому такие иРНК содержат серию старт (инициирующих)- кодонов. Обычно на 5’ - конце иРНК имеется лидерная последовательность из нескольких сотен пар нуклеотидов, расположенная перед первым старт-кодом. Кроме того, кодон, от которого начинается синтез следующего белка, разделен последовательностью из 5-20 п.н., называемой спейсером (от англ. spacer-прокладка). Стоп-кодоны часто располагаются парами (например, УАГ и УАА). За последним стоп–кодоном на 3’-конце иРНК располагается не кодирующая белок последовательность, называемая трейлером (от англ. treiler – прицеп). В состав лидерного участка входит последовательность 5’ -АГГАГГУ-3’, служащая сигналом на инициацию трансляции иРНК. Эта последовательность Шаин-Далгарно, называемая по имени ее открывателей, расположена на 4-7 основании влево от старт-кодона и, по-видимому, обеспечивает присоединение иРНК к рибосоме за счет связывания с 16SрРНК, на 3’ - конце которой часто встречается последовательность, комплементарная последовательности Шаин-Далгарно. Эффективность трансляции бактериальных иРНК, лишенных последовательности Шаин-Далгарно, низкая. Наряду с этим в связывании иРНК с рибосомами участвуют и ряд белков

Эукариотическая иРНК

В отличие от короткоживущих прокариотических иРНК в клетках млекопитающих около 50% иРНК имеют период полураспада около 6 часов и более. Особенно стабильна эукариотическая иРНК в дифференцированных клетках, синтезирующих специальные белки. У эукариот иРНК всегда списывается с одного, а не сразу с нескольких генов, организованных у прокариот в опероны. Стартовым кодоном служит АУГ и никогда – ГУГ. Характерная особенность эукариотических иРНК– наличие «колпачка», или кэпа (от англ. сар – колпачок). «Кэп» представляет собой гуанозин, атом углерода которого в 7 положении несет метильную группу СН. Образовавшийся 7-метилгуанозин (МеГ) присоединяется к 5’ - концу РНК-предшественника. Метилированию часто подвергается одна-две рибозы, ближайшие к 5’ - концу. Предполагается, что «кэпирование», происходящее в цитоплазме вскоре после начала синтеза РНК-предшественника, защищает иРНК от разрушения клеточными нуклеазами и способствует ее распознаванию рибосомами. «Хвост» на 3’ - конце молекул иРНК представляет собой последовательности из 20-200 адениновых нуклеотидов. Такой поли(А)-хвост не кодируется ДНК, а добавляется к РНК-предшественнику в ядре после окончания транскрипции. При переходе этой РНК из ядра в цитоплазму ее «хвост» укорачивается. Предполагается, что полиаденилирование эукаритической иРНК повышает ее стабильность (это существенно, учитывая продолжительность ее жизни) и каким-то образом связано со сплайсингом. У эукариот, так же как и бактерий, иРНК составляет всего 3% от всей клеточной РНК. В настоящее время разработаны методы выделения индивидуальных иРНК.

Транспортные РНК

В раскрытии механизма трансляции важную роль сыграла предложенная Криком (1958) гипотеза, согласно которой распознавание аминокислот в процессе синтеза белка происходит не прямо путем взаимодействия между ними и соответствующими кодонами иРНК, а с участием промежуточных молекул– адаптеров. Такие молекулы действительно были скоро открыты. Ими оказались тРНК. Эти небольшие (4 S) молекулы длиной 75–85 нуклеотидов имеют характерную вторичную структуру в форме листа клевера, образующую вследствие формирования водородных связей между комплементарными нуклеотидами в разных участках молекулы. В этих участках тРНК имеют дуплексную структуру. Три такие структуры завершаются одноцепочечной петлей, внутри которой спаривания не происходит. Одна из петель содержитантикодон – триплет, комплементарный какому–либо кодону в иРНК. Структура некоторых тРНК была впервые расшифрована р. Холли (1965) в США и А. А. Баевым (1967) в СССР. В результате выявилась не только сложная вторичная структура тРНК, но обнаружилось, что в их первичную структуру входят необычные нуклеотиды (инозин, превдоуридин, метилгуанин и др.), образующиеся в ходе посттранскрипционной модификации тРНК.

Спаривание антикодона тРНК и соответствующего ему кодона иРНК происходит таким образом, что третье (3’) основание кодона связывается с 5’-основанием антикодона, например кодон 5’ - АГУ - 3’ ---- связывается с антикодоном 3’ - EWF-5’. Однако ввиду вырожденности кода может существовать несколько тРНК, распознающих различные кодоны одной аминокислоты, или же антикодон определенной тРНК способен спариваться с несколькими кодонами. Однако ввиду вырожденности кода может существовать несколько тРНК, распознающих различные кодоны одной аминокислоты, или же антикодон определенной тРНК способен спариваться с несколькими кодонами. Прочные водородные связи с антикодоном образуют только первые два азотистых основания.

При этом всегда соблюдается принцип комплементарности. В результате третье основание кодона начинает «колебаться», то есть спариваться с различными, не обязательно комплементарными основаниями. Эксперимент полностью подтвердил эту гипотезу, называемую гипотезой «качелей» или уоббл–гипотезой (от англ. wobble– колебаться). Вследствие образования таких качелей антикодон одной из тРНК способен распознать от одного до трех различных кодонов одной аминокислоты. Вместе с тем каждая аминокислота имеет 1–4 специфичные тРНК, к которым она присоединяется, образуя аминоацил-тРНК. Этот процесс сопряжен с затратой большого количества энергии для образования эфирной связи между СООН-группой аминокислоты и ОН–группой рибозы последнего основания в тРНК, которым всегда является аденин.

Формирование аминоацил–тРНК – двухэтапный процесс, катализируемый специальным ферментом– синтетазой. Каждая из 20 аминокислот имеет, по крайней мере, одну собственную аминоацил–тРНК–синтетазу. Аминоацилированная тРНК способна «распознать» соответствующий кодон в иРНК и подставить нужную аминокислоту в строящуюся полипептидную цепь в таком положении, которое облегчит образование пептидных связей между соседними аминокислотами.

«Распознавание» кодона антикодоном контролируется рибосомами. Рибосомы движутся вдоль иРНК в направлении 5’ ---3’, считывая кодоны путем присоединения к ним аминоацил-тРНК, несущих соответствующие антикодоны. К каждой иРНК присоединяется одновременно несколько рибосом, располагающихся вдоль ее молекулы на 90 нуклеотидов друг от друга. Такой трансляционный комплекс называют полирибосомойили полисомой. У бактерий полисомы намного крупнее, чем у эукариот. Это, в частности, связано с тем, что у прокариот иРНК имеют большую длину (особенно в случае полицистронной иРНК). Присоединение рибосом к иРНК происходит до окончания транскрипции. УE.coli каждая иРНК транслируется сразу 30 рибосомами в отрезке времени между ее транскрипцией и деградацией. У эукариот обычно к одной иРНК присоединяется менее 10 рибосом одновременно. В среднем у обеих групп организмов полисомы соответствуют величине синтезируемого полипептида.

В рибосомах имеются два сайта связывания с тРНК. Один из них, А(или аминоациальный) сайт: присоединяет входящую аминоацил–тРНК. ДругойР (пептидильный) – сайт, связан с тРНК предшествующей аминокислоты растущего полипептида. При перемещении рибосом вдоль иРНК аминоацил–тРНК переходит из А в Р–сайт по мере передвижения соответствующих кодонов иРНК. Распознавание кодонной специфичности аминоацил–тРНК определяется входящей в ее состав тРНК, но не аминокислотой. Искусственная замена аминокислоты, привязанной к тРНК при неизменном антикодоне, приводит к тому, что тРНК подставляет под иРНК новую аминокислоту.

Как отмечалось, генетический код содержит кодоны, инициирующие синтез белка. У прокариот к инициирующему кодону (АУГ, реже ГУГ) присоединяется особая инициаторная тРНК, являющаяся формилметионил–тРНК. Это означает, что синтез любого полипептида начинается с модифицированного метионина. В дальнейшем у многих полипептидов этот концевой формилметионин либо формильная группа отщепляются.

Этапы трансляции

Процесс трансляции подразделяют на три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.Стадия инициации включает все реакции, осуществляющиеся до формирования пептидной связи между первыми двумя аминокислотами. УE.coli инициация включает все реакции, осуществляющиеся до формирования пептидной связи между первыми двумя аминокислотами. УE. сoliот инициации транскрипции гена до появления в клетке его иРНК проходит около 2,5 мин, а соответствующего белка - еще 30 сек. Инициация синтеза полипептидной цепи происходит в момент формирования комплекса между иРНК, 30Sсубъединицей рибосомы и формилметионил–тРНК.

Стадия элонгации включает все реакции от момента образования первой пептидной связи до присоединения к синтезирующемуся полипептиду последней аминокислоты. У прокариот этап элонгации идет очень быстро; как отмечалось, при 37^оС в полипептид за 1 сек. включается в среднем 15 аминокислот. Следовательно, если исходить из того, что размер гена составляет около 1000 п.н., синтез кодируемого им белка из 300 аминокислот осуществляется всего за 20 сек. При этом в синтезе белка участвуют одновременно до 80% всех клеточных рибосом. У эукариот скорость синтеза белка существенно ниже: за 1 сек. при 37^оС в цепь включаются лишь около 5 аминокислот. На стадии терминации трансляции полностью синтезированный полипептид освобождается от концевой тРНК, а рибосомы отходят от иРНК. Когда один из терминирующих кодонов (УАГ, УАА либо УГА) окажется в сайте А, весь комплекс распадается: образовавшаяся полипептидная цепь вместе с присоединенной к ней аминоацил–тРНК концевой аминокислоты отделяется от сайта Р, соответствующая тРНК переходит в свободную форму, а рибосома диссоциирует на две исходные субъединицы, способные в дальнейшем к новому объединению путем самосборки.

Сформировавшийся в ходе трансляции полипептид полностью соответствует (колинеарен) кодирующему его гену. Это означает, что первые три нуклеотида структурной части гена соответствуют кодируемой ими первой аминокислоте в образующемся под контролем данного гена полипептиде, вторые три нуклеотида соответствуют второй аминокислоте в том же полипептиде и т. д.. Строгое доказательство колинеарности гена и полипептида было получено Ч. Яновским с соавторами (1964), выявившими полное соответствие взаиморасположения отдельных мутаций в гене tpr A E.coli, определяемого по проценту рекомбинации между мутантными сайтами и расстоянию между заменами аминокислот в кодируемом этим геном полипептиде А, входящем в состав фермента триптофансинтетазы. Подобная колинеарность была выявлена и при исследовании мутаций, ведущих к появлению нонсенс – кодонов и преждевременной терминации синтеза полипептидной цепи. В случае колинеарности размер белка, синтезирующегося в мутанте, должен соответствовать расстоянию между началом гена и мутацией. Это и было установлено при сравнении положения мутаций в гене фага Т4, кодирующем основной структурный белок фаговой головки, с заменами аминокислот в нем, обусловленными этими мутациями. Подсчитано, что в среднем одна аминокислота кодируется участком гена, равным 0,015 единицы рекомбинации. Отсюда следует, что ген длиной 4 единицы рекомбинации соответствует белку, состоящему примерно из 270 аминокислот. Наиболее прямые доказательства колинеарности были получены тогда, когда появилась возможность непосредственно сравнить нуклеотидные последовательности в отдельных генах с аминокислотными последовательностями в их продуктах. Такие доказательства были получены для гена, кодирующего белок оболочки РНК–содержащего бактериофага МS 2. Необходимо, однако, отметить, что у эукариот эта колинеарность полипептида кодирующему его гену не всегда прослеживается в виде непрерывной последовательности пар нуклеотидов, поскольку у эукариот кодирующие последовательности (экзоны) могут прерываться некодирующими (интронами). Это не противоречит концепции колинеарности, а лишь означает, что последовательность триплетов нуклеотидов, транскрибирующая в кодоны иРНК, а затем транслирующаяся в аминокислоты в коллинеарном полипептиде, не всегда непрерывна.