Спонтанный мутагенез

О существовании спонтанных мутаций было известно задолго до того, как был открыт индуцированный мутагенез, однако природа индуцированных мутаций известна намного лучше.

Первые попытки объяснить причины спонтанных мутаций основывались на данных, полученных при анализе радиационного мутагенеза. Поскольку существуют космические лучи и естественный фон радиоактивности, а кривые “доза-эффект” для ионизирующего излучения характеризуются отсутствием порога, то спонтанное мутирование генов, по крайней мере, отчасти, должно быть связано с действием этих факторов.

Подсчитано, что у дрозофилы естественный радиационный фон ответствен лишь за 0,1% спонтанных мутаций. Однако с увеличением продолжительности жизни организма эффект естественной радиации увеличивается. У человека его доля в общем объеме спонтанных мутаций может достигать 25%. Значительная часть мутаций у одноклеточных организмов и вирусов, классифицируемых как спонтанные, на самом деле вызвана естественным радиационным и УФ-облучением.

Усиливает образование спонтанных мутаций и повышение температуры окружающей среды. Каждые 10С повышения температуры могут увеличить частоту мутаций до пяти раз.

В основном же возникновение спонтанных мутаций связано не с внешними воздействиями на организм, а со случайными повреждениями генов и хромосом в процессе нормального клеточного метаболизма. Физиологическое состояние клеток также существенно влияет на спонтанный мутагенез. Повышение частоты естественных мутаций по мере увеличения возраста клеток было отмечено еще в 1933 г. М.С. Навашиным на семенах растений Crepis capillaris. К эндогенным факторам спонтанного мутагенеза относятся: 1) ошибки в ходе репликации ДНК; 2) ошибки репарации; 3) ошибки рекомбинации ДНК; 4) действие генов мутаторов и антимутаторов; 6) действие других факторов эндогенного происхождения.

Связь спонтанного мутагенеза с репликацией, репарацией и рекомбинацией днк

На возможную связь возникновения спонтанных мутаций с процессами репликации ДНК первыми указали Уотсон и Крик на основе представлений о таутомерных превращениях внутри молекулы ДНК. В результате редко возникающих перемещений атомов водорода из одних положений в пурине или пиримидине в другие, более стабильные, кетоформы тимина и гуанина и аминоформы аденина и цитозина подвергаются таутомеризации, превращаясь в менее стабильные энольную и иминоформы соответственно. Следствием таких переходов может быть образование АЦ- и ГТ-пар, ведущее к появлению спонтанных транзиций и трансверсий. Установлено, однако, что основной вклад репликации ДНК в возникновение спонтанных мутаций связан с ошибками в работе ДНК-полимераз и химической модификацией цитозина.

Подсчитано, что ошибки в ходе полимеризации ДНК возникают с частотой примерно 10^-5. Корректорная 3-5-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз снижает эту частоту до 10^-10 в расчете на включающийся нуклеотид. Репаративные процессы еще более уменьшают возможность возникновения подобных ошибок. Тем не менее, число их все же достаточно для возникновения генетически наследуемых изменений в данном гене, регистрируемых как спонтанные мутации. Связь спонтанного мутагенеза с функционированием ДНК-полимераз подтверждается данными о мутаторной активности мутантов E. coli с дефектной ДНК-полимеразой III. “Ошибающаяся” ДНК-полимераза обнаружена в клетках человека, больного лейкемией. Наряду с этим есть данные о возникновении спонтанных мутаций в отсутствие синтеза ДНК. Так, спонтанное появление ауксотрофов наблюдали в покоящихся спорах бацилл и актиномицетов, в высушенных клетках E. coli, во внеклеточно хранящихся бактериофагах. По-видимому, в этих условиях могут возникать повреждения, связанные с процессами депуринизации, делециями и другими химическими и структурными изменениями ДНК. Такие предмутационные повреждения могут реализовываться в мутации при последующем синтезе ДНК.

У E. coli большое число спонтанных мутаций возникает путем химической модификации одного из четырех оснований, присутствующих в ДНК. Такая модификация происходит in situ, т.е. на месте. Наиболее часто встречается модифицированное основание 5-метилцитозин (5-МЦ), обнаруживаемое как у про-, так и у эукариот. Фермент метилаза добавляет группу СН₃ к цитозину в определенных сайтах ДНК, в результате чего небольшая часть от общего числа цитозиновых оснований оказывается модифицированной. В отношении гена lacI E. coli, кодирующего репрессор лактозного оперона, показано, что “горячие точки” спонтанного мутагенза соответствуют сайтам, содержащим 5-МЦ. Во всех случаях мутация представляет собой транзицию ГЦАТ. В мутантах E. coli, дефектных по метилазе (dam^), такие “горячие точки” отсутствуют. Это связано с тем, что 5-МЦ часто подвергается дезаминированию, причем при замещении NH₂-группы на СО-группу 5-МЦ превращается в тимин. Подобная замена в свою очередь ведет к образованию ошибочной пары ГТ, которая при последующей репликации преобразуется в мутантную пару АТ. В принципе конечному дезаминированию может подвергаться не 5-МЦ, а непосредственно сам цитозин. При этом он переходит в урацил, но у E. coli есть фермент урацил-ДНК-гликозилаза, удаляющий урацил из ДНК. Это ведет к образованию неспаренного гуанина, против которого при последующем репаративном синтезе включается цитозин. В таком случае мутация не возникает. Поскольку дезаминирование 5-МЦ приводит к появлению в ДНК нормального для нее основания - тимина, репаративная система не распознает подобную замену как повреждение ДНК и возникает мутация.

Помимо репликации возникновение спонтанных мутаций может быть связано с репарацией ДНК. Наиболее полно такая система прослежена у E. coli. Мутации в гене uvrD (синоним uvrE), участвующем в репарации одноцепочечных разрывов, вызванных УФ-облучением, в сотни раз повышает частоту спонтанного возникновения транзиций АТГЦ. У мутантов polA, дефектных по ДНК-полимеразе I, повышена частота спонтанного образования точковых мутаций и делеций. Эксцизионная и пострепликативная (рекомбинационная) репарации не влияют на частоту спонтанных мутаций у бактерий, однако известны случаи, когда чувствительные к УФ-лучам бактерии обладают повышенной спонтанной мутабильностью. Выключение темновой репарации снижает частоту спонтанных мутаций. Все эти факты свидетельствуют о влиянии репаративных процессов на возникновение спонтанных мутаций, однако механизмы этого влияния не изучены.

Третий процесс, ведущий к образованию спонтанных мутаций, - генетическая рекомбинация. Данные по этому вопросу получены, главным образом, на дрожжах. К. Магни и Р. фон Борстеллем, обнаружившими феномен “мейотической рекомбинации”, состоящей в том, что спонтанные мутации со сдвигом рамки намного чаще отмечаются в мейозе, чем в митозе. Это позволило заключить, что причина мутации в мейозе - неравный внутригенный кроссинговер, приводящий к вставкам либо выпадениям оснований. Проявление данного мейотического эффекта специфично в отношении генов тРНК, мутации в которых приводят к возникновению суперсупрессоров.

Связь между спонтанным мутагенезом и рекомбинациями показана и на других объектах. У E. coli получены мутанты с повышенной рекомбинационной способностью, у которых одновременно увеличена и спонтанная мутабильность. У самцов дрозофилы выявлены мутанты, у которых частота рекомбинаций коррелирует с частотами сцепленных с полом аутосомных леталей.