Циль-Нильсен әдісімен бояу

Әдістемесі:

фиксацияланған жұғын-препаратқа карбол фуксинің бірнеше тамшысын тамызады, фильтр қағазбен жауып бу шыққанға дейін қыздырады, тағы 1-2 рет бояу тамызып қыздырады (3—5 мин);
фильтр қағазын алып тастап, жұғын-препаратты салқындатады, 5% күкірт қышқылы ертіндісі немесе 3% соляноқышқыл спиртімен (2-4 с) түссіздендіреді;
жақсылап сумен шаяды;
Леффлер сия көгімен бояу (3-5 мин);
Сумен жақсылап шайып, кептіру керек.

6. Микросптан қарау. Қышқылға тұрақты бактериялар рубинді-қызыл түсте, ал қалғандары – сия көк түске боялады.

Микроорганизмдерді тірі күйінде тексеру

Микроорганизмдерді тірі күйінде олардың пішінін, қозғалғыштығын немесе тірі күйіндегі ішкі құрылысын анықтау үшін зерттейді. «Езілген тамшы» немесе «ілінген тамшы» әдісін қолдана отырып нативті және боялған препараттарды зерттейді.

Тірі күйінде (витальді) бояу.

0,001% метилен көгінің немесе бейтарап қызылдың ерітіндісінің тамшысына микроорганизмдердің қоспасын енгіземіз. Содан соң «езілген» немесе «ілінген» тамшы препаратын дайындаймыз және микроскоптаймыз

«Езілген тамшы» препаратын дайындау. Майсыздандырылған заттық шынының ортасына сұйық сорпа дақылының 1 тамшысын тамызамыз. Егерде дақыл тығыз қоректік ортада өсірілген болса, онда 1тамшы стерильді натрий хлоридінің изотоникалық ерітіндісін тамызып, сосын ілмекпен дақылдан алып, ілінген бактерияны тамшымен араластырамыз.

Немесе изотоникалық ерітіндіде микроорганизмдер қоспасын дайындап,содан 1 тамшы алуға болады. Зерттелетін материалға жабын шыныны жабамыз, ауа тамшыларын қалдырмай. Тамшы алғанда оның көлемі заттық шыны мен жабын шынының ортасын ғана толтырып, жиегінен аспауы керек. Препараттың құрғақ жүйемен де иммерсиондық жүйемен де көруге болады. 40х және 90х объективпен микроскоптайды. Өте жақсы нәтижелерді қараңғы алаңдық немесе фазалы – контрасты құрылымдарды қолдануы арқылы алады. Препараттар жылдам кеуіп кетеді, сондықтан егерде біршама уақыттан кейін қарайтын болса, онда оны ылғал камераға (Петри ыдысына ) түбіне 2-3 ылғал дөңгелек фильтрлі қағазды бетін құрғақ қағазбен жауып орналастырамыз. Препарат кеуіп кетпес үшін және сұйықтықтың турбуленті қозғалысының конвекциясын тудырмас үшін оны герметизациялауға болады. Бұл мақсатта парафин майын, парафин мен вазилиннің тең көлемін немесе тырнаққа арналған лакты қолдануға болады. Қозғалғыш микроорганизмдер кейде шыныға адгезияламайды, сондықтан қозғалғыштықты «ілінген тамшыда» оңай көруге болады.

«Ілінген тамшы» препаратын дайындау.

Препаратты жабын шыныда дайындайды, яғни ортасына 1 тамшы бактерия қоспасын тамызады. Ойығы бар заттың шынының жиегін алдын ала вазилин майымен майлап жабын шыныға жабыстырады. Жылдан препаратты жабын шыныға бетіне шығарып аударады. Герметикалық жабық камера пайда болады, бұл кезде тамшы ұзақ уақыт кеуіп кетпейді.Дұрыс дайындалған препаратта тамшы ойық түбіне жиегіне жетпей еркін ілініп тұрады. Жабын шыны бетінен микроскоптайды, алдымен жиегін тауып алу керек 8х құрғақ объективте сосын үлкен объективте – бақылауды жалғастырамыз. Микроорганизмдердің қозғалғыштығын броундық қозғалыстан ажырата білу керек, яғни ол кезде ерітінді молекулаларының бактерияға соғылды нәтижесінде тербеліс пайда болады. Кейбір қозғалғыш микроорганизмдер өте жылдам қозғалады да, бақылауды қиындайды. Микроорганиздер суспензиясына метилцеллюлозаны қосу арқылы осыны төмендетуге болады, және осы кезде талшықтардың қозғалысын көруге болатындай жағдай жасалынады. Осы әдістің жеткіліксіздігіне бірнеше оптикалық деректілер, яғни ойық қисығына байланысты жоғары сапалы микрофотографиялар алу қиынға түсуде, сонымен қатар қараңғы алаңдық және фазалы-контрасты құрылымдарды қолдану ойығы бар заттың шыныны қалыңдығымен байланысты мүмкін болмай отыр.

Қараңғы алаңдық микроскоптау.

«Езілген тамшы» препаратындағы тірі микробтарда қараңғы аймақта зерттеуге болады. Микроскоптаудың бұл әдісінде заттық шынының қалыңдығы 1,2 мм-ден, жабын шыны 0,2мм аспауы керек.

Микробтарды қараңғы аймақта зерттеу принципі мынаған негізделген объектив пен бақылаушының көзіне тікелей сәуле түспейді, тек зерттелуші объектінің шағылысқан жарығы түседі. Осының нәтижесінде жарықтанбаған көру аймағы қараңғы күйінде қалады, алмикробтық денелер, жарық сәулесін шағылыстырады да анық жарықтанған күйде болады.

Қараңғы алаң жағдайын жасау үшін Аббе конденсорын қараңғылаудың конденсорын, яғни ортасында қаранғыланған бөлімі бармен алмастырамыз. Арнайы жабдық болмаған жағдайда Аббе конденсорын бұрап аламыз да оның линзалары арасына қара фотоқағаздың дөңгелегін орналастырамыз, яғни линзаның перифериялық бөлігі бос қалатындай етіп орналастырамыз. Қараңғы алаңдық аймақта микроскоптау кезінде конденсордың жоғарғы бетіне 1 тамшы кедр немесе вазелин майын тамыздырып, арасында ауа қалдырмай бетіне препаратты орналастырамыз. Жабын шыныға 1 тамшы май тамыздырамыз. Екі бетке де орналасқан май иммерсиондық жүйемен микроскоптау кезінде өтетін сәуле жарығы сынбау үшін. Жарық көру ретінде кәдімгі 100- 200 эектролампа қолданылады, ОИ-19 жарықтандырғышы немесе күн сәулесі, біртегіс жарықтанатын жалпақ айна. Вегатативті торшаларға қарағанда оларда бос су өте аз болады, ал липид пен кальций көп мөлшерде байланысты.

Электронная микроскопия.

Ценность этой микроскопии в способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическим микроскопом. Малая длина волны электронов позволяет различать объекты в 0,2 нм. Различают просвечивающую (трансмиссивную) и сканирующую (растровую, туннельную) электронные микроскопии. Сущность первой: изображение получают благодаря прохождению электронов через образец; при сканирующей – пучок электронов просматривает поверхность образца, вызывая отражение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране (по аналогии с формированием телевизионного изображения).

В электронных микроскопах различают 3 системы: электронно-оптическую, вакуумную, электропитания. Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900⁰С при подаче постоянного напряжения до 100кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его различной толщины и электроноплотности отклоняются под различным углом и попадают в объективную линзу, формирующую первое полезное увеличение объекта. После объективной линзы электроны попадают в промежуточную, предназначенную для главного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта.

Бактериялардағы капсуланы анықтау.

Кейбір микробтар өзінің термо қабығының беткейіне мықты кілегейлі қабат түзе алады,оны капсула да капсула құрамына негізінен полисахаридтер,ал кейбірінде олар полилипидтер (сібір түйнемесі таяқшасы) кіреді. Капсула консистенциясы гель тәрізді болады, сондықтан тірі бактерияны микроскоптау кезінде ол нашар көрінеді. Олардың табу үшін негативті бояуды қолданады. Аталған барлық бояу түрлері позитивтерге жатады, яғни олармен бояғанда микроб торшалары боялады. Негативтік әдісте бояу бактерия айналасындағы кеңістікті толтырады, осының нәтижесінде олар қара алаңдағы жарық бөлшектер түрінде көрінеді.

Бурри-Гинс әдісі бойынша капсуланы табу.

Заттық шыныда аз мөлшерде капсулалы дақылды (1:9) сұйытылған тушь араластырамызда, жұқа жұғын дайындаймыз. Ауада кептіріп, микроскоптаймыз. Қараңғы алаңда түссіз капсулалар анық көрінеді. Бурри-Гинс бойынша модификация кезінде конгорот бояуы фонында 5% тұз қышқылында бекітілген және қосымша сулы фуксинмен бояуда мынандай нәтиже көрінеді: жалпы фон қараңғы, капсула түссіз, ал бактериия денесі – қызыл.

Иллюстративті материал

Сурет 1. Бактериялардың негізгі пішіндері:

Бактериялардың негізгі пішіндері: 1-3. Кокктар (стафилококктар, диплококктар, стрептококктар. 4. Таяқшалар (стрептобациллалар). 5. Клостридиялар. 6. Вибриондар. 7. Коринебактериялар. 8. Фузобактериялар. 9. Нокардиялар (шынайы тармақтану). 10. Актиномицеттер (жалған тармақтану). 11. Спирохеталар.

Сурет 2. Бактериялардың морфологиясы бойынша жіктелуі:

	стафилококктар
	стрептококктар
	сарцина
	диплококктар
	бактериялар (спора түзбейтін таяқшалар)
	Клостридиялар (анаэробты спора түзетін микробтар)
	Спириллалар