Лабораторные работы для выполнения на практических занятиях

Раздел VIII. Биохимия тканей и жидкостей полости рта

Биохимия смешанной слюны

Слюна — смесь секретов слюнных желез, выделяющихся в полость рта и участвующих в пищеварении.

В полость рта выделяется секрет околоушной, поднижнече- люстной, подъязычной желез, малых слюнных желез полости рта, образуя смешанную или так называемую ротовую жидкость. К ротовой жидкости примешиваются эпителиальные клетки, части­цы пищи,¹ нейтрофильные лейкоциты (слюнные тельца), слизь, микроорганизмы.

У человека в сутки выделяется до 1,5-2 литров слюны. Слю­на, секретируемая околоушной железой, невязкая, сравнительно богаче водой, белком, ферментами, хлоридами калия и натрия. Секрет, выделяемый поднижнечелюстной и подъязычной желе­зами, содержит больше органических веществ (муцин, амилаза), вязкий.

Состав, рН, объем смешанной слюны непостоянны, колеб­лются в зависимости от скорости секреции, характера пищи, вре­мени суток, состояния организма, воздействия внешних факто­ров, заболеваний полости рта и т. д.

Удельный вес колеблется от 1,001 до 1,017; рН — 6,4-7,2; содержание воды — 99,5%. Из неорганических веществ пре­обладают: натрий — 20-40 мэкв/л, калий — 16-20 мэкв/л, каль­ций — 6-20 мг/дл, хлор — 20-40 мэкв/л, бикарбонаты — 20- 40 мэкв/л. Содержатся фосфаты, йодиды, фториды (их содер­жание часто выше, чем в плазме крови), а также сульфаты и родййидь!. Основными органическими компонентами смешан­ной слюны являются белки — до 0,26-0,3%:- альбумины, бета- и гамма-глобулины, иммуноглобулины, лизоцим, гликопроте- ин Муцин, ферменты — альфа-амилаза, липаза, мальтаза, фер­менты гликолиза, цикла трикарбоновых кислот, факторы свер­тывающей системы крови, коллагеназа, нуклеазы.

Уровень остаточного азота колеблется от 108 мг/л до 206 мг/л, лактата — 2-4 мг/л, пирувата — 20-40 мг/л.

В слюне постоянно обнаруживаются (следовые количества) аскорбиновая кислота, витамины В^ В₂, РР и др.

Состав слюны изменяется при ряде заболеваний. Например, при нефрите, осложненном уремией, в слюне возрастает количе­ство остаточного азота, содержание его увеличивается и при яз­венной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. При са­харном диабете повышено содержание глюкозы. Названные по­казатели могут быть использованы как диагностические тесты в клинической практике.

Работа. Определение рН слюны

На диагностическую полоску бумаги (любой формы) наносят каплю слюны и тотчас сравнивают с эталонной шкалой. Можно использовать и лакмусовую бумагу.

Работа. Определение минеральных компонентов слюны

а) Определение хлоридов. В пробирку вносят 10-15 капель слю­ны, добавляют 2-3 капли 30% азотной кислоты и 3-4 капли 1% рас­твора азотнокислого серебра. Образуется осадок хлорида серебра.

б) Обнаружение кальция — Са⁺⁺. К 1 мл слюны добавить 1-2 капли 3% уксусной кислоты и 1-2 капли аммония щавелевокис­лого (4% раствор). Выпадает осадок щавелевокислого кальция.

Записать реакции а и б.

в) Обнаружение фосфатов. В пробирку наливают 1 мл мо­либденового реактива, нагревают почти до кипения. После этого добавляют 10-15 капель слюны. Выпадает (не сразу) желтый оса­док фосфорномолибденовокислого аммония, нерастворимый в азотной кислоте.

г) Обнаружение роданидов. Роданиды обнаруживаются по появлению красного окрашивания при добавлении к слюне хло­рида железа. Образуется красное комплексное соединение, со­держащее железо и роданид.

Ход работы. В маленькую пробирку вносят 5 капель слюны (только что взятой), 2 капли 2% раствора кислоты хлористоводо­родной и 2 капли раствора хлорида железа. Возникает красное окрашивание, интенсивность которого зависит от содержания в слюне роданидов. Особенно яркое окрашивание наблюдается у курильщиков. Сравните!

Работа. Открытие органических компонентов слюны

Открытие белков в слюне. Белки в слюне можно определить биу- ретовой реакцией и сульфосалициловой кислотой (см. работу 1).

Работа. Выделение и свойства муцина слюны

Муцин относится к гликополипопротеидам, т. е. сложным белкам, имеющим в составе углеводы и липидный компонент. Раствор муцина обладает большой вязкостью, благодаря чему пищевой комок делается скользким, легко проглатывается и про­двигается по пищеводу.

Муцин осаждается концентрированной уксусной кислотой. Углеводная группа обнаруживается реакцией с альфа-нафтолом (реакция Подобедова — Молиша).

Ход работы. В одну из двух пробирок помещают 2 мл слю­ны и прибавляют 4-5 капель концентрированной уксусной кисло­ты (избегать избытка!): Выделяется осадок муцина. Сгусток вы­нимают стеклянной палочкой, помещают в другую пробирку и про­делывают реакцию Подобедова — Молиша: к сгустку добавляют 4-5 капель спиртового раствора альфа-нафтола, перемешивают и по стенке подслаивают около 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев жидкости постепенно появляется фиолетово-красное кольцо.

Оставшийся в первой пробирке после удаления сгустка му- , цина раствор, содержащий все белки, кроме муцина, фильтруют, и фильтрат делят на 2 части с одной проделывают биуретовую реакцию, а к другой прибавляют 1/3 объема насыщенного рас­твора сернокислого аммония и кипятят, выпадает осадок белка.

Работа. Открытие каталазы

Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в строме эритроцитов и печени. В процессе окисления некоторых веществ образуется перекись водорода, ядовитая для организма, которая может в нем накапливаться.

Биологическая роль каталазы заключается в разложении вредной для организма перекиси водорода на молекулярный ки­слород и воду

2НO » 2Н₂O+O₂

каталаза

Фермент каталаза содержит гем. В процессе разрушения перекиси водорода происходит окисление и восстановление же­леза, входящего в состав фермента (установленного спектраль­ным анализом).

Ход работы. Действие каталазы слюны. В две пробирки берут по 1 мл воды, добавляют по 2 капли слюны, и одну пробирку кипятят 2-3 минуты для инактивации фермента. После охлаждения в обе про­бирки добавляют 5-10 капель 3% раствора перекиси водорода, встря­хивают и наблюдают за выделением пузырьков кислорода. При встря­хивании кипяченой пробы выделения пузырьков не происходит.

Работа. Реакция на молочную кислоту

При некоторых заболеваниях полости рта в смешанной слю­не может содержатся в повышенном количестве молочная кисло­та, что является фактором риска развития кариеса.

Принцип и ход работы по определению молочной кислоты описан в «Обмен углеводов»

Работа. Определение амилазной активности слюны

Метод основан на определении минимального количества фермента, которое способно в стандартных условиях (30 мин./37°С) расщеплять 1 мл 0,1% раствора крахмала. Это минимальное коли­чество фермента принимают за единицу амилазной активности. Она выражается количеством мл 0,1% раствора крахмала, которое может расщепляться одним миллилитром неразведенной слюны.

В норме амилазная активность слюны равна 320-640 услов­ным единицам.

Ход работы. Из бюретки наливают в 10 пронумерованных пробирок по 1 мл дистиллированной воды.

В первую пробирку отмеривают 1 мл слюны, в 10 раз разве­денной. Перемешивают содержимое троекратным втягиванием пипеткой жидкости из пробирки и обратно, 1 мл полученного рас­твора переносят из первой пробирки во вторую, вновь смешива­ют, переносят в третью и т. д. Из последней пробирки после пе­ремешивания 1 мл смеси выливают. Получается ряд разведений. Концентрация фермента в каждой последующей пробирке в 2 раза меньше, чем в предыдущей: в 1-й пробирке разведение в 20 раз (1/20), во второй в 40 раз (1/40) и т. д. Во все 10 пробирок из бюретки наливают по 2 мл крахмала, содержимое пробирок пе­ремешивают и помещают в водяную баню на 30 минут при 37°С.

Через 30 минут пробирки вынимают, быстро охлаждают под струей холодной воды и прибавляют по 2 капли раствора йода, смешивают. Желтый цвет свидетельствует об отсутствии крах­мала (он гидролизован полностью), бурый цвет — о присутствии различных декстринов, синий — о наличии негидролизованного крахмала. Отмечают последнюю пробирку с желтым окрашива­нием (далее пробирки с синим окрашиванием).

Расчет. Допустим, нет синего окрашивания в пятой про­бирке. В ней содержится 1/320 мл неразведенной слюны. Если 1/320 мл неразведенной слюны расщепляет 2 мл 0,1% раствора крахмала, то 1 мл слюны расщепляет X мл крахмала.

X = ((2-1/1)/1)/320 = 2-320/1 = 640

Амилазная активность равна 640 условным единицам

К методическим рекомендациям