6.3. Максимально очищенные органопрепараты для парентерального применения
Данная группа представляет собой органопрепараты экстракционного типа, в которых первичный экстракт глубоко очищен от балластных и сопутствующих веществ.
Указанная группка органопрепаратов подразделяется на:
1. Препараты из животного сырья, содержащие комплекс БАВ, максимально очищенные от балластных и сопутствующих веществ.
2. Препараты, полученные на основе индивидуальных БАВ, выделенных из сырья животного происхождения.
Процесс производства препаратов данной группы строго индивидуален, но можно выделить следующие стадии:
Технологическая схема получения препаратов
индивидуальных веществ
ВР – 1. Санитарная подготовка производства
ВР – 1.1. Подготовка производственных помещений
ВР – 1.2. Обработка оборудования
ВР – 1.3. Санитарная подготовка технологической одежды
ВР – 1.4. Санитарная подготовка персонала
ВР –2. Подготовка сырья и экстрагента
ВР-2.1. Измельчение сырья
ВР-2.2. Подготовка экстрагентов
ТП – 3. Экстракция (получение извлечения)
ТП – 4. Очистка извлечения и получение технического продукта
ТП – 5. Очистка технического продукта (выделение индивидуальных веществ)
ТП – 6. Стандартизация
УМО – 7. Фасовка, упаковка, маркировка
ПО – 8. Переработка отходов
Стадии ВР – 1 и ВР – 2 проводятся аналогично препаратам предыдущих групп.
ТП – 3. Экстракция. Извлечение БАВ при получении максимально очищенных препаратов проводится аналогично препаратам предыдущей группы, но особое внимание уделяют подбору оптимальных параметров технологического процесса – температурного режима, времени экстрагирования, РН среды и т.д.
ТП – 4. Очистка. Особенностью парентеральных препаратов является глубокая, максимальная очистка от балластных и сопутствующих веществ. В классической технологии обычно предусматриваются следующие виды очистки, последовательность и способы проведения которых могут быть самые разнообразные:
. Грубая очистка
Очистка от белков проводится следующими методами:
- отстаиванием извлечений на холоду (0-4 0С);
- высаливанием (т. е. добавлением солей тяжелых металлов, спирта этилового высокой концентрации, дубильных веществ);
- доведением до изоэлектрической точки (способом кислотно-щелочной обработки);
- термофракционированием.
Очистка от жиров проводится следующими методами:
- отстаиванием на холоде (0-4 0С);
- экстрагированием органическими растворителями (авиационный бензин, эфир).
. Очистка от низкомолекулярных органических веществ и веществ, используемых при грубой очистке, проводится с использованием следующих способов:
- диализа;
- электродиализа;
- осаждения;
- ультрафильтрации.
Первые три способа очистки изложены в разделе «Новогаленовые препараты» (см. выше).
Ультрафильтрация
Ультрафильтрацию и обратный осмос объединяет общий термин – гиперфильтрация. Ультрафильтрация – это процесс проникновения растворителя и низкомолекулярных соединений из раствора в растворитель через полупроницаемую мембрану с диаметром пор до 0,1мкм. Препятствием для диффузии более крупных молекул служит структура мембраны. Обратный осмос – процесс проникновения растворителя через полупроницаемую мембрану из раствора в растворитель. Отличительной особенностью ультрафильтрации и обратного осмоса от обычного фильтрования является то, что на мембранах не образуется осадка, и перераспределение веществ осуществляется только в жидкой фазе (рис. 21).
Рис. 21. Мембранные методы разделения низкомолекулярных
и высокомолекулярных веществ
НМ – низкомолекулярные вещества;
Р1 – давление над раствором в сосуде 1;
Р2 – давление над раствором в сосуде 2;
– осмотическое давление раствора.
Если осмотическое давление раствора в сосуде 2 больше, чем давление над раствором ( > Р2), то наблюдается явление осмоса, в результате которого вода из сосуда 1 будет проникать через мембрану в сосуд 2 (рис. 21 А). При превышении давления над сосудом 2 выше осмотического давления (Р2 > ) будет наблюдаться обратный осмос или ультрафильтрация (рис. 21Б). Обратный осмос заключается в движении молекул воды через мембрану из сосуда 2 с раствором в сосуд 1 с растворителем, в результате чего происходит концентрирование раствора. При ультрафильтрации из раствора в растворитель будут проникать не только молекулы воды, но и низкомолекулярные вещества, в результате чего достигается очистка раствора или извлечения от низкомолекулярных (разделение высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений). Движущей силой обратного осмоса или ультрафильтрации является разность давления над раствором и осмотическим давлением (Р = Р2-). Установки для ультрафильтрации работают под давлением 3-10 кгс/см2, для обратного осмоса 70-80 кгс/см2. Основные различия между ультрафильтрацией, осмосом и обратным осмосом представлены в табл. 11.
Таблица 11
Отличительные особенности обратного
осмоса и ультрафильтрации
№ пп |
Показатель |
Ультрафильтрация |
Обратный осмос |
1. |
Размер пор в мембране, мкм |
До 10-1 |
Не менее 10-2 |
2. |
Давление в установках для фильтрования, кгс/см2 |
3-10 |
70-80 |
2. |
Вещества, проникающие через мембрану |
Растворитель и низкомолекулярные примеси |
Растворитель |
3. |
Сфера применения |
Очистка от низкомолекулярных (или высокомолекулярных соединений) |
Концентрирование конечного продукта |
Мембраны, используемые при обратном осмосе и ультрафильтрации. Для изготовления мембран используют различные полимеры. В зависимости от структуры мембраны делят на две группы: пористые и непористые. Скорость фильтрации через непористые мембраны очень мала. Непористые мембраны в зависимости от метода получения делят на диффузионные и гелевые (образуются при ограниченном набухании в воде). В настоящее время для ультрафильтрации и обратного осмоса используются только пористые мембраны.
Пористые мембраны состоят из непроницаемой основы, пронизанной каналами. В зависимости от технологии изготовления могут быть цилиндрическими с постоянным или переменным диаметром и иметь форму усеченного конуса (рис. 22).
Рис. 22. Схематичное изображение пористых мембран
Материалами для изготовления пористых мембран служат эфиры целлюлозы, полиуретан, ПВП и др. При аппаратурном оформлении процессов обратного осмоса и ультрафильтрации стараются обеспечить:
большую площадь фильтрации на единицу объема;
равномерное распределение раствора по поверхности мембраны;
низкий перепад давления;
простоту смен мембран;
герметичность.
Наиболее простым по конструкции аппаратом, в котором используются мембраны в виде пластин, является обычный фильтр-пресс.
ТП – 5. Очистка технического продукта (выделение индивидуальных веществ)
Данная стадия присутствует только в технологии индивидуальных органопрепаратов. Для выделения индивидуальных веществ из очищенных экстрактов-сырцов (технического продукта) используют различные виды хроматографии:
1. Ионообменную
2. Адсорбционную
3. Гель-хроматографию (ситовую, проникающую).
4. Афинную (лигандную)
На конечных этапах практически всегда используется перекристаллизация.
Гель-хроматография (хроматография на основе «молекулярных сит»)
В качестве сорбента используют гель с определенным радиусом пор (рис. 23), поры геля как бы смазаны жидкостью имеющей сродство к выделяемым веществам. При пропускании очищенного извлечения через колонку с гелем выделяемые вещества (ферменты, гормоны и т. д.) задерживаются в порах геля. Элюирование веществ с колонки осуществляется той же жидкостью, которая находится в порах геля.
2
1 3
А Б
Рис. 23. Гель-хроматография
1 – ВМС
2 – низкомолекулярное соединение
3 – частицы геля
А – частицы геля с ВМС и низкомолекулярными соединениями
Б – молекулы разделяемых веществ
Аффинная (лигандная) хроматография
В основе лигандной хроматографии лежит аффинитет (сродство) выделяемого вещества и лиганда. Лиганды подразделяются на специфичные и групповые (табл. 12, 13).
Таблица 12
Специфичные лиганды, используемые
в аффинной хроматографии
Лиганд |
Отделяемый продукт |
Субстрат Кофактор (кофермент) Ингибитор Рецептор Гепарин Антитела Гепарин |
Фермент Фермент (апофермент) Фермент Гормон Фактор коагуляции крови Антигены Антитело |
Таблица 13
Групповые лиганды, широко используемые в различных
вариантах аффинной хроматографии
Лиганд |
Определяемый продукт |
Алкильная или арильная группировка Функциональные группы органических красителей Агенты хелирующие металлы Активированные SH-группы |
Различные белки
То же То же Белки с SH-группами |
При этом одни и те же вещества могут выступать и в роли лигандов и в роли определяемых продуктов.
Различают несколько вариантов аффинной хроматографии:
1. Аффинная хроматография или аффинная адсорбция на геле (достаточно широко используется).
2. Аффинная преципитация – внедряется.
3. Аффинное разделение – внедряется.
1. Аффинная хроматография или аффинная адсорбция на геле (достаточно широко используется)
Данная разновидность аффинной хроматографии в настоящее время используется наиболее широко. Так, например, при выделении ферментов, сорбентом служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. При пропускании через колонку извлечения фермент взаимодействует с содержащимся субстратом, что приводит к его удерживанию. После насыщения колонки фермент элюируют с нее подходящим растворителем. Разделение по методу афинной хроматографии может быть основано на других специфических взаимодействиях: фермента с ингибитором, гормона с рецептором и т. д.
2. Аффинная преципитация
В данном случае лиганды прикрепляют к растворимому носителю. При добавлении к данной системе смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после введения раствора электролита. Осадок отделяется и при необходимости из комплекса выделяется чистое вещество.
3. Аффинное разделение
Основано на использовании двух водорастворимых полимеров. Один полимер (например, полиэтиленгликоль) несет специфические лиганды, другой полимер обладает сродством к остальным, примесным компонентам. Так, например, необходимо отделить ферменты от смеси белков, нуклеиновых кислот, фрагментов клеточных структур. Для этого используют смесь полиэтиленгликоля, несущую молекулы лиганда (субстрат, кофактор, ингибитор) и полярный декстран:
Ф, Б, НК + ПЭГ (Л) + ПД = ПД * Б * НК + ПЭГ (Л) * Ф
где:
ПЭГ (Л) – полиэтиленгликоль, несущий молекулы лиганда (субстрат, кофактор, ингибитор); Ф, Б, НК – ферменты, белки, нуклеиновые кислоты; ПД – полярный декстран (растворимый).
Дальнейшее разделение на основании различной растворимости образованных комплексов.
Аффинное разделение является самым эффективным способом аффинной очистки.
ТП – 6. Стандартизация
Стандартизация максимально очищенных органопрепаратов для парентерального применения проводится по тем же показателям, что и других химических соединений. Особенностью является то, что очень часто применяются биологические методы стандартизации, основанные на специфическом действии соединений. Например: препараты инсулина стандартизуют по способности снижать содержание сахара у кроликов; препараты питуитрина – по способности вызывать сокращение изолированного рога матки морской свинки.
УМО – 7. Фасовка, упаковка, маркировка
Является предварительной стадией, т.к. ввиду нестойкости соединений сразу идет передача готового, стандартного продукта на изготовление лекарственных форм.
Получение лекарственных форм
Получение лекарственных форм на основе максимально очищенных препаратов это отдельный технологический процесс. Технологическая схема данного процесса зависит от вида лекарственной формы (раствор или суспензия), но, как правило, кроме стадий вспомогательных работ в технологической схеме имеются следующие основные стадии технологического процесса:
ТП – 2.1. Растворение (суспендирование)
При проведении данной стадии очищенная сумма веществ или выделенное вещество растворяют (или суспендируют) в необходимом растворителе. При необходимости доводят до определенного значения РН и добавляют консерванты (фенол 0,25-0,3 %, глицерин, нипагин).
ТП – 2.2. Стерилизация
Большинство гормонов и ферментов являются термолабильными веществами, поэтому для их стерилизации применяют стерильное фильтрование (см. тему «Инъекционные растворы») и в дальнейшем простерилизованный раствор высушивают лиофильно.
Общие сведения о максимально-очищенных
органопрепаратах
Наибольшее (распространение) значение среди максимально очищенных органопрепаратов имеют препараты гормонов щитовидной железы, задней и передней доли гипофиза, железы.
Инсулины
Инсулин – гормон поджелудочной железы, регулирующий углеводный обмен. Инсулин представляет собой небольшой глобулярный белок содержащий 51 аминокислотный остаток и состоящий из двух полипептидных цепей (цепь А – 21 остаток, цепь В – 30 остатков), которые связаны дисульфидными мостиками.
Выпускаемые в настоящее время препараты инсулина классифицируются:
I. По видовой принадлежности (по источнику получения)
Согласно данной классификации инсулины подразделяются на две группы:
1. Инсулин, получаемый из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней (бычий, быче-свиной, свиной).
2. Инсулин человеческий (обозначение – НМ).
Производство инсулина на основе поджелудочной железы крупнорогатого скота осуществляется крайне редко, т. к. говяжий инсулин отличается от инсулина человека на три аминокислоты, что влечет при введении в организм человека интенсивную выработку антител к чужеродному белковому соединению. Для производства животного инсулина чаще используют поджелудочную железу свиньи. В молекуле свиного инсулина в тридцатом положении цепи В содержится аланин, а в человеческом – трионин, поэтому свиной (суинсулин, актрапид) менее иммуногенный. В 1980 году фармацевтическая компания «Ново индастри» (Дания) разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека путем замещения 30-го остатка аланина в цепи В на остаток треонина.
В настоящее время человеческий инсулин получают двумя методами:
1. Из свиного инсулина путем соответствующих ферментативных превращений.
2. Методом генной инженерии путем получения штамма кишечной палочки или дрожжей активно вырабатывающих инсулин.