Охлаждение

После разбавления несколько капель образца исследуют под микроскопом, а разбавленную сперму сливают в пластиковые центрифужные пробирки, которые помещают в сосуд с водой, подогретой до 35 °C. Затем сосуд переносят в холодильник и оставляют на 2 часа при температуре 4 °C. За это время сперма охлаждается до 4–5 °C, а глицерин, выполняющий роль защитного фактора, проникает в мембрану сперматозоидов.

Упаковка

Сперму вынимают из холодильника, осторожно взбалтывают и немедленно помещают в пластиковые соломины (пайетты) емкостью 0,5 мл. Для выполнения процедуры применяют специальный отсос или насасывают ртом через латексную трубку. При распределении спермы следует проследить за тем, чтобы порошок, находящийся между концами фильтров соломины, пропитался жидкостью и затвердел. Сначала соломины заполняют наполовину, после чего, оставляя пузырек воздуха, доливают, не доводя 1 см до верха. Пузырек воздуха препятствует переливанию спермы (за счет изменения давления при размораживании). После этого соломину запечатывают.

Техника замораживания

Существуют два альтернативных метода заморозки — ручная (статический протокол) и автоматическая (динамический протокол). Доля глицерина в составе разбавителя зависит от применяемого метода. При ручной заморозке используют контейнер (30 х 40 х 30 см) из полистирола со съемной металлической полкой, помещенной на 10 см ниже края. Контейнер заполняют жидким азотом до уровня, находящегося на 4 см ниже полки.

Заполненные соломки (8–10 максимально) захватывают пинцетом, помещают горизонтально на полку и оставляют в испаряющемся азоте на 8 минут. Затем пинцет охлаждают в жидком азоте, приподнимают и поворачивают с его помощью пайетты, одну за другой, чтобы удостовериться в полной кристаллизации их содержимого. После этого пайетты погружают в жидкий азот. Такую процедуру называют статической в связи с присутствием постоянного нерегулируемого потока испаряющегося азота в период охлаждения и заморозки.

Автоматическая заморозка подразумевает использование машины. Такой способ называют динамическим, поскольку испаряющийся азот поступает в морозильную камеру с различной скоростью в зависимости от заданной программы, позволяющей регулировать темпы заморозки. Программа заморозки осуществляется автоматом Planer 10™, разработанным Hofmo (1988) для замораживания спермы лисиц. В настоящее время этот прибор используется в лаборатории автора, располагающей обширным запасом образцов спермы. Пайетты замораживают в горизонтальном положении на полке со съемной крышкой, причем в морозильной камере может находиться несколько таких полок. Программа заморозки включает следующие режимы:

• -2 ºС/мин. начиная с +4 °C до -7 °C;

• -50 ºС/мин. от -7 °C до -100 °C;

• -25 ºС/мин. от -100 ºС до -180 °C.

после окончания процедуры полку помещают непосредственно в жидкий азот.

Размораживание

Пайеггы размораживают на водяной бане (в термосе) при температуре 70 ºС в течение 8 секунд. После размораживания их ставят вертикально фильтром вниз, распечатывают крышку, встряхивают, чтобы пузырек воздуха мог подняться вверх. Соломку вскрывают и несколько капель образца помещают на подогретое предметное стекло для оценки параметров спермы после размораживания. До восстановления подвижности сперматозоидов проходит некоторое время, обычно 2 минут бывает достаточно. В связи с тем, что разные лаборатории используют различные техники замораживания, при размораживании образца спермы, полученного из какой-то определенной лаборатории, необходимо строго соблюдать все полученные оттуда рекомендации, поскольку процессы замораживания и размораживания тесно связаны между собой.

ИСКУССТВЕННОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ

Искусственное осеменение свежей спермой

Практикуется в случаях, если естественная вязка невозможна по ряду причин: кобель и сука живут довольно далеко друг от друга; заводчик намерен осеменить несколько сук или опасается прямого контакта суки с производителем в связи с распространенностью инфекционных заболеваний.

Искусственное осеменение замороженной спермой

Обычно предпринимают, если производитель находится далеко, а отправить свежую сперму не представляется возможным, либо в связи с запретом провозить через границу свежую сперму, либо в случае гибели производителя. В Европе и США существуют банки спермы в национальных собачьих клубах, в научных институтах и в некоторых частных компаниях.

Определение даты осеменения

При наличии свежей спермы процедуру осеменения проводят в день овуляции, а потом через 2 дня повторяют. При использовании замороженной спермы, которая характеризуется сниженной жизнеспособностью, поскольку процессы замораживания и размораживания оказывают негативное воздействие на акросомы и мембраны сперматозоидов, — осеменение осуществляют через 1–2 дня после овуляции, и вторую процедуру проводят через 24 часа после первой. Пробы прогестерона в сыворотке крови служат хорошим индикатором овуляции. Концентрация прогестерона, определяемая радиоиммунным методом, должна поддерживаться на уровне 30 нмоль/л (10 нг/мл) в первый день и между 55 и 75 нмоль/л (18–25 нг/мл) на второй день осеменения. Быстрый иммуноферментный метод (ELISA) определения также подходит для оценки качественного и количественного содержания прогестерона. У лисиц искусственное осеменение позволяет добиваться увеличения численности помета, и при правильном выборе даты оплодотворение наступает в результате одной процедуры.