Сохранение спермы

Для искусственного осеменения свежесобранной спермой ее разбавлять необязательно. Однако если предполагается транспортировка спермы и использование через 2–3 часа, ее разбавляют специальными разбавителями и транспортируют при температуре 4 ºС, поскольку такие условия способствуют поддержанию жизнеспособности сперматозоидов. Для транспортировки свежесобранной спермы автор с успехом применяет два вида разбавителей (табл. 9.1 и 9.2).

В эксперименте было проведено сравнение разбавителей, содержащих яичный желток, яичный желток в сочетании со сметаной и яичный желток в сочетании с молоком. Для хранения спермы при 4 ºС лучше всего подходит разбавитель TRIS. Во всех растворах желток предохраняет мембрану сперматозоидов от шока, вызываемого воздействием низкой температуры. Разведение спермы обычно проводят в соотношении 1:6 в зависимости от первоначальной концентрации. Важно, чтобы объем раствора превышал объем спермы, и если при сборе сперму не разделяли на фракции, ее центрифугируют и, удалив излишки секрета предстательной железы, смешивают с раствором.

Табл. 9.2. Желточно-сливочный разбавитель для свежеполученной охлажденной спермы

Пастеризованные сливки 12 % жирности — 8 мл;

Яичный желток 20 % от объема — 2 мл.

Охлаждение при транспортировке обеспечивают, помещая образец в термос, частично заполненный колотым льдом. Для перевозки образца используют пластиковые пробирки для центрифуги (например, пробирку на 10 мл с завинчивающейся крышкой для клеточной культуры).

Пробирку с образцом помешают в изолированную колбу, колбу кладут в термос поверх слоя льда и оборачивают бумагой. Перед осеменением сперму постепенно согревают до 30–35 °C.

Замораживание спермы

В литературе имеется подробное описание множества протоколов разведения, замораживания и размораживания спермы. Автор настоящей главы предпочитает работать с разбавителем TRIS, обеспечивающим хороший результат при хранении спермы собак и лисиц. Успешность последующего осеменения составляет 67–80 % при внутриматочном осеменении с использованием спермы с концентрацией 50–150 х 10⁶ сперматозоидов в спермодозе и проведением осеменения в два приема с интервалом в 24 часа.

Обработка и замораживание спермы собак Подготовка и разбавление

Для замораживания к основному раствору TRIS добавляют глицерин и антибиотики (табл. 9.1). Объем добавляемого глицерина составляет от 12 до 16 мл (6 и 8 % общего объема соответственно) в зависимости от техники замораживания: для автоматического замораживания добавляют 6 % глицерина, для ручного — 8 %. В раствор добавляют дистиллированную воду (188 или 184 мл вместо стандартных 200 мл).

В базовый раствор TRIS с глицерином добавляют 20 % яичного желтка. Яичный желток получают от кур, проверенных на отсутствие патогенных факторов (предназначенных на экспорт или домашних). Желток отделяют от белка, выкладывают на лист чистой бумаги, осторожно прокалывают и сливают в воронку и энергично взбивают стеклянной лопаткой, максимально измельчая его частицы, — это позволяет снизить связывание головок сперматозоидов частицами желтка, затрудняющее анализ спермы. Наконец, желток смешивают с буферным раствором TRIS, предварительно подогретым до 30 ºС. Смесь хорошо взбалтывают и нагревают до 35 ºС. Предварительно приготовленный разбавитель можно замораживать и сохранять в таком виде в течение 2 месяцев. Перед применением его размораживают на водяной бане при температуре 35 ºC.

Проводят микроскопическое исследование спермы на соответствие перечисленным выше критериям, затем ко второй фракции эякулята добавляют по каплям подогретый до 35 ºС разбавитель, пока необходимая концентрация не будет достигнута. В лаборатории автора для замораживания обычно используют образцы с общей концентрацией сперматозоидов 100 х 10⁶/мл. Однако при высоком качестве спермы концентрацию можно уменьшить наполовину.