книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

Объединяя уравнения (6) и (7), можно записать уравнение Вант-Гоффа, связывающее тепловыделение с температурой плав­ ления и концентрацией геля. Это уравнение в окончательной

Теплота гелеобразования, найденная по уравнению (8), равна 46 ккал/молъ из данных [93]. При этом, как и в работе Меерсон и Липатова [71], наблюдалось отклонение от линейной зависи­ мости при концентрациях желатины, больших 30 г/100 мл. Этот факт также указывает на существенную роль гидрофобных вза­ имодействий.

Светорассеяние растворов и гелей желатины

Метод измерения интенсивности рассеяния света в примене­ нии к растворам белков и полимеров стал одним из точных ко­ личественных методов, позволяющих определить такие важные характеристики, как молекулярный вес, размер и форму макро­ молекул, а также термодинамические параметры межмолекуляр­ ного взаимодействия в растворах [139—142].

Дебай [143—146] теоретически и экспериментально развил метод светорассеяния в применении к растворам полимеров и показал возможность использования метода светорассеяния для исследования твердых негомогенных полимерных тел. Метод светорассеяния позволяет обнаружить не только фазовые превра­

предсказанную Дебаем и подробно исследованную Эскиным

[147-150].

Дебаем [151] впервые был применен метод светорассеяния для изучения ККМ низкомолекулярных ПАВ. Развитие метода ока­ залось очень плодотворным для изучения ККМ, определения раз­ мера, формы и мицеллярного веса как для иояогенных, так и для неионогенных ПАВ в различных условиях [152—1541.

Метод светорассеяния широко применяется для определения агрегации в растворах белков и полимеров [155—158]. Методом светорассеяния растворы желатины впервые изучались Бедткер и Доти [77]. Эти авторы показали, что при 40° С в разбавленных

80

растворах желатина находится в молекулярно-дисперсном сос­

плавления молекулы желатины образуют агрегаты, молекуляр­

в работах Бейера [159] и Энгеля [1601.

Светорассеяние в концентрированных растворах полимеров изучалось в работе Дебая и Бики [144]. Они показали, что кривая зависимости мутности от объемной фракции полимера проходила через максимум при малых объемных заполнениях. Для того же полимера ^полистирол в различных растворителях — бензоле, этилбензоле, толуоле, хлорбензоле, четыреххлористом углероде, циклогексане, декалине) Тагер и сотр. [161, 162] показали, что зависимость избыточного рассеяния от концентрации выражается кривой с максимумом, высота которого и положение по оси кон­ центрации зависят от взаимодействия полимера с растворителем, т. е. определяется термодинамикой растворения.

В другой работе Тагер и сотр. [163] изучали методом свето­ рассеяния фазовые равновесия растворов полистирол — цикло­ гексан и поливинилацетат — этилацетат, для которых строились диаграммы состояния в широком диапазоне температур. Возраста­ ние светорассеяния при изменении температуры или концентра­ ции всегда связано с увеличением флуктуаций концентрации, которые при определенных условиях могут из «гомогенных» флуктуаций превратиться в «гетерогенные», т. е. стать зароды­ шами новой фазы.

Возможность объективно установить различие между одно­ фазными растворами высокомолекулярных соединений (в которых неоднородности могут носить лишь чисто флуктуационный харак­ тер) и двухфазными коллоидно-гетерогенными дисперсными си­ стемами рассмотрена Влодавцем и сотр. [18] на примере системы поливиниловый спирт — вода также с использованием метода светорассеяния.

Бедткер и Доти [77] методом светорассеяния изучали гели желатины. Было отмечено, что рассеяние света при комнатной температуре гелями в несколько раз больше, чем при 40° С рас­ творами. Ими также было высказано предположение на основании экспериментальных данных, что агрегаты, образующиеся в ге­ лях, идентичны агрегатам, образующимся в^растворах. Однако количественная характеристика элементов структуры геля (аг­ регатов) желатины по методу светорассеяния представляет боль­ шие трудности.

Дебай и Бики [144] впервые предложили метод корреляцион­ ных функций для расчета размеров негомогенности в твердом полимерном теле по данным измерения светорассеяния. Однако этот метод применим в том случае, если рассеивающие центры расположены неупорядоченно. Как впервые было обнаружено

81

Доти и Бедткер [77], приведенная интенсивность светорассеяния уменьшалась в гелях с увеличением концентрации желатины, что авторы объяснили увеличением упорядоченности рассеиваю­ щих центров. Следовательно, методом рассеяния неполяризованного света нельзя получить количественную оценку параметров элементов структуры упорядоченных гелей.

Штейн [164], Баранов [165], Френкель и сотр. [166] разрабо­ тали новый метод анизотропного рассеяния света (рассеяние поляризованного света под малыми углами), который позволяет определить флуктуации ориентации и плотности в твердых поли­ мерных кристаллических телах.

Рис. 12. Теоретические зависимо­ сти H v от sin (0/2) для беспоря­

дочно ориентированных бесконеч­ но тонких анизотропных рассеи­ вающих стержней для разных значений Lfk [167]

1 — 1; 2 — 1,5; 3 — 2; 4 — 3

Принс и сотр. [167] впервые применили метод анизотропного рассеяния света для исследования концентрированных и раз­ бавленных гелей поливинилового спирта и полигликольметакрилатов; было показано существование в этих системах анизотроп­ ных стержнеобразных рассеивающих образований L размером порядка 3 Я, где К — длина волны падающего света. В работе были измерены Vv и 1Д (компоненты рассеянного света) и на ос­ новании уравнений, связывающих H v (горизонтальная компонен­ та рассеянного света) с ЫК и с оптической анизотропией 6 рассеи­ вающего элемента, могут быть вычислены с использованием ЭВМ размеры анизотропных рассеивающих образований. На рис. 12 представлены рассчитанные авторами зависимости lg Hv от sin (0/2) для бесконечно тонких стержней длиной L и различных соотношений Ык. Этот метод, безусловно, представляет интерес для исследования структурообразования в системах, содержащих биополимеры. Однако требуется дальнейшая разработка и услож­ нение модели в связи с необходимостью учета и введения попра­ вочных членов из-за изменения поляризации света вследствие спо­ собности этих полимеров вращатьплоскость поляризованного света.

82

Метод измерения интенсивности светорассеяния был приме­ нен нами для обнаружения новой фазы в водных растворах же­ латины при охлаждении, для изучения развития новой фазы во времени в процессе структурообразования, а также влияния различных условий (концентрации желатины, температуры, pH среды и мочевины) на процесс возникновения и развития новой фазы.

Измерение интенсивности рассеянного света проводили на приборе ФПС-2М, сконструированном и изготовленном в ЦКБ АН СССР. Действие прибора основано на регистрации углового распределения интенсивности релеевского рассеяния света исследуемым веществом. Измеряли относи­ тельную интенсивность рассеянного света при неполяризованном падающем луче (U) и Я = 4360 А под углом 90° — (Б “0„) и 45° и 135° (z = й “50/Д " 50).

Относительную интенсивность рассеянного света при условии, что градуи­ ровка прибора произведена по бензолу при 25° С и X = 4360 А, рассчиты­ вали по формулам для неполяризованного света и:

(9)

для вертикально-поляризованного света V:

(Ю)

где А в ( х ) — показания на шкале прибора под углом 0, для исследуемой си­

стемы; И90о 6енз — показания на шкале прибора для бензола при 0 = 90 и 25° С; пх — показатель преломления исследуемого раствора; лбенз — по­ казатель преломления для бензола; Аи — величина деполяризации для

бензола.

Интенсивность светорассеяния Bg0° в растворах 0,5 г/100 мл и гелях желатины концентрации 1, 2, 5, 10, 20, 30 г/100 мл изу­ чалась во времени при 6, 12, 20, 40° С. В качестве примера на

рис. 13 приведены зависимости Т?9 0° от времени для разбавленных растворов желатины (0,5 г/100 мл) и малоконцентрированных гелей (2 г/100 мл). Интенсивность светорассеяния растет во вре­ мени, достигая максимального значения для 0,5 г/100 мл раствора желатины через четверо суток, для гелей 1—2 г/100 мл — через одни сутки. Характер зависимости интенсивности светорассеяния

от времени и предельное значение величины i?g0° сохраняется и в случае не фракционированной желатины, а лишь очищенной

по методу Леба [176]. Характер зависимости i?g0° от времени изменяется с увеличением концентрации гелей желатины. Для гелей желатины при концентрации 20 и 30 г/100 мл не наблюдалось изменения интенсивности светорассеяния во времени при всех изученных температурах (рис. 14), тогда как для концентраций 5—10 г/100 мл наблюдалась слабая зависимость; нарастание Т?90о в о времени наблюдается лишь при температурах ниже ком­ натной.

83

Обращает на себя внимание тот факт, что при 40° С, а также при низких температурах при введении в систему мочевины не

наблюдается изменения Щ0° во времени в широком интервале концентраций желатины (от 0,5 до 50 г/100 мл). Отсутствие за­ метного индукционного периода в изменении светорассеяния в растворах и гелях желатины свидетельствует о большой скорости процессов выделения новой фазы и о том, что процесс разделения на две фазы не лимитируется стадией образования зародышей. Это отмечалось и ранее в работе [18] по изучению образования новой аморфной фазы из метастабильных растворов полимеров.

Рис. 13. Изменение интенсивности светорассеяния R^0<>растворов фракцио­

нированной желатины концентрации 0,5 г/100 мл (а) и 2 г/100 мл (б) при pH 4,9 во времени при различных температурах

1 — 40°; г — 20; 3 — 12°; 4 — 6° С

Исследования кинетических закономерностей светорассеяния для растворов и гелей желатины в кислых (pH 3 ) и щелочных (pH 9) областях обнаружили сходство с аналогичными зависимос­ тями, установленными для изоэлектрического состояния желатины (pH 4,9). Отличие наблюдалось только в скорости нарастания

Для гелей желатины (10—30 г/100 мл) при 6, 12 и 20° С интенсив­ ность светорассеяния также не изменялась от pH. При малых концентрациях гелей желатины (1—2 г/100 мл) максимальная интенсивность светорассеяния наблюдалась в изоэлектрическом состоянии, по-видимому, вследствие того, что агрегирование молекул желатины значительно усиливается электростатическими взаимодействиями, которые приводят к образованию более плот­ ных агрегатов. Интенсивность светорассеяния равновесной сис­ темы желатины увеличивается с повышением концентрации же­

латины, а затем при дальнейшем увеличении концентрации резко падает.

84

Растворы желатины, приготовленные в 8 М растворе мочевины, дают лишь небольшое увеличение интенсивности светорассеяния при увеличении концентрации желатины (рис. 15), причем вели­ чина интенсивности на порядок меньше, чем в 0,15 М растворе хлористого натрия. Введение электролита в высококонцентриро­ ванные гели желатины в 8 М растворе мочевины не влияет на интенсивность светорассеяния. Характеризовать параметры рас­ сеивающих центров в растворах и гелях желатины можно, анали­ зируя данные измерения интенсивности светорассеяния под уг­ лами 45 и 135°. Эти измерения позволяют вычислить асимметрию

рассеяния z = R%5°IRiS5°. Для растворов желатины при 40° С, когда макромолекулы находятся в конформации статистического клубка, по методу Дебая была оценена характеристическая асим­ метрия макромолекул желатины [z] = 1,13. Из зависимости ха­ рактеристической асимметрии [z] от относительных размеров (й2А,2)‘> [177] получаем величину (Р/Х2)1^, равную 0,15, отсюда величина (/г2)1'2 (среднеквадратичное расстояние между концами макромолекул) равна 650 А. Полученная величина (Н2)'1г хорошо согласуется с данными Гуинлока, Флори, Шераги [178] — 590— 740 А, Курца и Стейнсби [180]—650 А. Согласно Вейсу и Коэну

[179], среднеквадратичный радиус энерции (Я2У1‘ также равен

314—444 А.

Среднеквадратичное расстояние (Р)1''2, приведенное в работе Доти и Бедткер [77] и равное 258 А, значительно отличается от приведенных выше. Очевидно, величина (Р)1/г, найденная в указанных работах, для желатины соответствует среднеквадра­ тичному расстоянию между концами полимерной цепи, харак­ терному для статистического клубка. Однако следует отметить, что реальное состояние макромолекул желатины скорее соответст­ вует клубкам, стабилизованным внутримолекулярными взаимо­ действиями, например гидрофобными [126—136]. Наличие гидро­ фобных областей в макромолекулах желатины при 40° С в водных растворах показано нами при исследовании солюбилизации угле­ водородов в этих условяих [181] (см. гл. I).

Концентрационная зависимость К“0° для растворов и гелей желатины также имеет сложный вид [182]. Эта зависимость свето­ рассеяния от концентрации желатины обсуждается рядом иссле­ дователей. Вейс [177] объясняет уменьшение интенсивности свето­ рассеяния в гелях желатины уменьшением размеров кристаллов при увеличении концентраций. Однако, согласно Бедткер и Доти [77], следует считать маловероятным, что постепенное увеличение размеров агрегатов, обнаруженное в разбавленных охлажденных растворах желатины, должно пойти в обратном направлении с увеличением концентрации в процессе гелеобразования. Наблю­ даемое явление уменьшения интенсивности светорассеяния с увеличением концентрации скорее объясняется упорядочением сис­ темы. В подтверждение этого мнения Бедткер и Доти проанализи-

85

Л& n t c/i1

от температуры в присутст­ вии 8 М раствора мочевины

2 — через 30 м ин; з — через

5 час;

4 — через 2 суток,

5 — через 3 суток;

6 — через 4 суток

R3D'Ю*см1

ровали концентрационную зависимость для плотного газа, состоя­ щего из очень больших жестких сфер, предположив, что распре­ деление агрегатов (рассеивающих центров) в геле аналогично распределению, которое можно было бы ожидать, если бы агре­ гаты были кинетически независимы. Было показано, что расчеты, основанные на этой модели, предсказывают максимум на кривой

увеличением концентрации могут служить рентгенографические исследования Каца и Дерксена [183], Генгросса с сотр. [184] и Меерсон и Заграевской [185]. Сложная зависимость интенсив­ ности светорассеяния от концентрации проявляется даже при 40° С и в присутствии мочевины при условиях, когда нет структурообразования, так как на величину интенсивности светорассея­ ния влияет не только размер рассеивающих областей, но и их ориентация. Как было показано Флори [186, 187], по мере запол­ нения объема системы макромолекулярными клубками уменьша­ ется число разрешенных конфигураций и клубки в местах кон­ тактов начинают разворачиваться, что приводит к изменению конформации макромолекул.

С понижением температуры от 40 до 6° С интенсивность свето­ рассеяния резко растет при малых концентрациях (до 2 г/100 мл) (рис. 16) и не изменяется от температуры в области концентрации 5—30 г/100 мл (рис. 17). Добавление 8 М раствора мочевины приводило к независимости светорассеяния от температуры и при малых концентрациях (см. рис. 16). Интенсивность свето­ рассеяния, увеличивающаяся со временем, обусловлена появле­ нием и развитием агрегатов, которые, как было показано в [77], достигают по молекулярному весу нескольких миллионов.

Опыты по изучению светорассеяния в водных системах жела­ тины в присутствии 8 М раствора мочевины показывают, что мочевина препятствует выделению новой полимерной фазы. Неза­

висимость 7?вЭ от времени и температуры для высококонцентри­ рованных гелей подтверждает, что измерение этой величины не может характеризовать структуру этих гелей и что нужно при­ менять другие методы светорассеяния, разрабатываемые для твер­ дых тел [164, 167].

Структурно-механические свойства гелей желатины

Гели желатины представляют собой твердообразные дисперс­ ные системы при относительно небольшом содержании белка. Многообразие физических и физико-химических свойств реальных тел определяет разнообразие подходов и методов для характе­ ристики их структурно-механических свойств. Структурно-меха­ нические свойства полимеров должны исследоваться в условиях чистого однородного сдвига, это позволяет определить все дефор­

87

мационные характеристики таких систем: условно-мгновенный модуль, равновесный модуль эластичности, периоды релаксации, эффективную вязкость истинного течения и вязкость неразру­ шенной структуры [188]. Гели желатины, обладающие твердооб­ разными свойствами, неоднократно подвергались структурно­ механическим исследованиям. Впервые механические свойства 0,5—1%-ных гелей желатины были изучены Шведовым [86], который установил пластично-вязкое поведение таких систем, т. е. их течение при напряжениях выше предела упругости. Одна­ ко Шведов не обнаружил эластических свойств растворов жела­ тины, так как изучал недостаточно концентрированные растворы.

Количественные исследования эластическо-вязкостных свойств 5—15%-ных гелей желатины, выполненные Ивановой-Чумако­ вой, Ребиндером и Крус [87], показали, что при непродолжи­ тельном действии нагрузки развитие и спад эластической дефор­ мации студней желатины совпадают.

Зависимости деформации гелей желатины от температуры, концентрации, времени и напряжения изучались в работах Сло­ нимского и Толстогузова и сотр. [88, 89], которые показали, что модуль упругости изменяется в пределах от 103 до 107 дип/см2.

Исследования структурно-механических свойств студней же­ латины в присутствии дубителей (танин формалин, сульфат хро­ ма), проведенные Григорьевой, Пчелиным и Ребиндером [189] путем измерения деформации сдвига с помощью ротационного эластовискозиметра, показали увеличение модуля упругости студ­ ней желатины под действием дубителей.

В работах Козлова и Ундзенаса и сотр. [190, 191] при вве­ дении пластификаторов (этиленхлоргидрин и диметилсульфоксид) в растворы желатины было обнаружено резкое смещение темпе­ ратуры конформационного перехода спираль — клубок, что ав­ торы объясняли изменением структуры воды под действием этих пластификаторов. Пленки, полученные из гелей желатины в присутствии пластификаторов, обнаруживали понижение сверх­ сокращения. Это явление имеет большое технологическое значе­ ние в эксплуатации пленок желатины при повышенных темпера­ турах ( > 200° С).

Большое число работ посвящено исследованию релаксацион­ ного поведения гелей желатины. По данным Ферри и сотр. [192, 193], 6%-ные гели желатины характеризуются набором периодов релаксации от 103 до 10е сек. При этом каждой температуре соот­ ветствует свой набор периодов релаксации и увеличение темпе­ ратуры сдвигает спектр релаксации в сторону меньших значений. Изменение периодов релаксаций напряжений в гелях желатины при изменении условий указывает на существование связей в гелях различной прочности. Представление о наборе связей в гелях развивалось также Трапезниковым [194]. Релаксационное поведение гелей желатины изучалось Зубовым, Журкиной и Кар­ гиным [59], которые выявили большое различие в характере ре­

88

лаксации в разбавленных и концентрированных гелях. В кон­ центрированных гелях наблюдался большой набор периодов релаксации. Различие в свойствах разбавленных и концентриро­ ванных гелей было обнаружено также Леви и Руденко [195]. Жоли [69] и Леви [196] исследовали вязкость растворов желатины до образования трехмерной структуры геля, когда система на­ ходится в вязкотекучем состоянии.

Анализ работ по исследованию структурно-механических свойств гелей желатины показывает, что все исследователи изучали уже сформированные гели. Механизм же образования пространственных структур гелей желатины и развитие структуры во времени не был исследован. Однако согласно развиваемым нами представлениям о структурообразовании в дисперсных сис­ темах [1—3], такие исследования необходимы для выявления ме­ ханизма процессов развития пространственных структур. Харак­ терно, что процесс возникновения и развития пространственных структур протекает во времени, поэтому кинетические законо­ мерности здесь являются основными. Из всех применяющихся в настоящее время методов измерения структурно-механических свойств дисперсных систем нашей задаче наиболее соответство­ вали метод тангенциально-смещаемой пластинки [197] и метод конического пластометра [198, 199], позволяющие по одной из механических характеристик исследовать развитие пространст­ венных структур во времени.

Метод тангенциально-смещаемой пластинки был предложен Вейлером и Ребиндером [197] для измерения прочности структурированных дисперсных систем. Этот метод заключается в измерении усилия, необходимого для сдви­ га (срыва) пластинки, погруженной в структурированную дисперсную си­ стему.

Кювету с исследуемой системой и погруженной в нее пластинкой зак­ репляют на подвижном столике, который опускают со скоростью 3 см/мин.

Пластинку через стержень с микрофотошкалой присоединяют к пружинкединамометру, которую предварительно калибруют. При опускании столика с сосудом пружинка растягивается и к пластинке с известной боковой по­ верхностью S прикладывают определенное напряжение сдвига Р, которое

легко рассчитать, зная деформацию пружины и соответствующую этому силу

Растяжение пружины определяют при помощи микроскопа по микро­ шкале. Этот метод применим только в том случае, если скольжение по боко­ вой поверхности пластинки отсутствует. Для устранения скольжения в на­ ших системах использовали плексиглазовые пластинки с рифленой поверхно­ стью высотой 2 см и шириной 1,5 см с острой горизонтальной нарезкой глуби­

89