книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

Pk.r/см2

Рис. 25. Изменение прочности пространственных структур водного раствора желатины во времени (pH 5,8; 20° С)

лемы, а именно — переход от пространственной структуры в ра­ створах желатины к коацерватам. Для этого изучено изменение механических свойств гелей желатины при добавлении сернокис­ лого натрия, этилового спирта и резорцина вплоть до образования коацерватов.

Коацерваты готовились по следующей методике: водные раство­ ры желатины нагревались до 50° С, затем при постоянном и тща­ тельном перемешивании по каплям вводились соответствующие добавки (количество реагентов варьировалось в широком интер­ вале концентраций). Приготовленные таким образом растворы

Рк, Г/см 2

Рис. 26. Изменение прочности пространственных структур в коацерватном слое и равновесной жидкости во времени (pH 4,8;

2 — студень без добавки соли;

3 — коацерватный слой

либо быстро охлаждались до комнатной температуры и в них изу­ чался процесс структурообразования, либо растворы выдержива­ лись при 50° С в течение 24 час; при этом происходило расслаивание системы на два слоя и изучались структурно-механические свой­ ства верхнего и нижнего слоев.

Данные представлены на рис. 25. Из рисунка видно, что не­ большие добавки (сернокислого натрия, спиртов и резорцина),

100

введенные в водные растворы желатины, повышают прочность сис­ темы, затем прочность уменьшается и при концентрациях добавок, достаточных для образования коацерватов (выделения частиц но­ вой лиофильной фазы), прочность становится равной нулю (кри­ вая 1).

Прочность нижнего коацерватного слоя на порядок больше прочности исходного геля, как это видно из рис. 26.

Таким образом, механические свойства гелей желатины могут быть очень чувствительным параметром определения коацервации, т. е. расслоения системы на две фазы [217].

СТРУКТУР00БРА30ВАНИЕ

ВВОДНЫХ РАСТВОРАХ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

Вразличного рода биологических процессах большую роль

играют гели, образующиеся из глобулярных белков. Однако до сих пор не изучен и остается неясным механизм возникновения структурных элементов геля и процессов взаимодействия между ними, приводящих к образованию прочных гелей. Следует указать, что в литературе недостаточно полно охарактеризованы и свойства образующихся гелей, так как практически отсутствуют физико­ химические исследования таких систем. Рассмотрим результаты исследований гелеобразования в растворах глобулярный белков на примере яичного альбумина и казеинов.

Оптическая активность и конформация казеина в водных растворах

Казеин — основной белок молока млекопитающих составляет 80% всех белков. Как и все белки, казеин является оптически ак­ тивным веществом и характеризуется левым вращением. Иссле­ дованию оптического вращения казеина посвящено множество работ.

В работах [218, 219] изучалась зависимость удельного опти­ ческого вращения казеина от pH. Согласно данным авторов, кри­

вая зависимости [а]о от pH для казеина подобна кривым для сы­ вороточного и яичного альбумина, лицетина и других белков. Ав­ торы [218] исследовали также температурную зависимость удель­ ного оптического вращения нефракционированного казеина. Ис­ следования проводились в интервале температур от 20 до 60° С. Оказалось, что удельное оптическое вращение не зависит от тем­ пературы. Однако в более поздних работах содержатся указания на то, что оптическая активность казеина и его а- и [5-фракций за­ висит от температуры [220]. В этой работе на основании измерения дисперсии оптического вращения при двух разных температурах 1,5 и 25° С подсчитаны параметры а0и Ь0из уравнения Моффита — Янга и значения Хс. Изменение оптического вращения с температу­ рой, очевидно, обусловлено склонностью а- и [5-фракций казеина к

'101

эндотермической ассоциации. В работах [221—225] были рассчи­ таны термодинамические характеристики процесса ассоциации ка­ зеина — энтальпия и энтропия, которые оказались положитель­ ными величинами, и был сделан вывод, что при ассоциации воз­ никают гидрофобные взаимодействия между мономерами. Возмож­ ность образования гидрофобных связей при ассоциации а- и [5- казеинов определяется высоким содержанием у этих фракций ами­ нокислот с неполярными боковыми цепями, что было показано в ряде работ [226—233].

Крешек на основании изучения конформационного состояния казеина и его фракций в водных растворах также считает гидро­ фобные взаимодействия ответственными за процессы тепловой аг­ регации Р-казеина [234, 235].

Несколько иные результаты для температурной зависимости оптического вращения Р-казеина были получены Гарнье [236, 237]. Он анализировал данные по дисперсии оптического вращения (ДОВ) при переходе температуры от 5 к 40° С и нашел, что цепь Р- казеина частично свернута в спираль типа поли-£-пролин II и из­ менение в дисперсии оптической активности объясняется уменьше­ нием содержания спирали типа поли-£-пролин II и увеличением содержания а-спирали. Возможность существования в Р-казеине участков цепи с укладкой типа поли-Г-пролин II (особенно при низких температурах) отмечается и в работах других авторов

[238, 239].

В работах Крешека и сотр. [234, 235] конформация казеинов в растворах изучалась методами светорассеяния и дисперсии опти­ ческого вращения. Значения Хс оказались равными 233 и 218 ммк для нефракционированного казеина и 212 ммк для Р-казеина, что характерно для белков с конформацией статистического клубка. Авторы также считают, что казеин не существует в а-спиральной форме из-за высокого содержания пролина; было высказано пред­ положение, что конформация статистического клубка обусловлива­ ет склонность казеина к агрегации. Гидрофобные взаимодействия, которые в общем случае стабилизируют спиральные конформации, не могут проявиться в стабилизации внутримолекулярных упоря­ доченных структур из-за высокого содержания пролиновых остат­ ков и проявляются в межмолекулярных взаимодействиях, приво­ дящих к агрегации (особенно тепловой).

Эту точку зрения разделяют многие исследователи [226—233, 240-344].

В последнее время появились работы, посвященные разработке новых методов анализа данных по дисперсии оптического вращения [245—248]. В нашей работе [249] используется метод обработки данных по ДОВ, предло­ женный Имахори и Инони [248]. Этот метод позволяет оценить вклад каждой из трех известных в настоящее время конформаций (а-спираль, [3-структура и статистический клубок) в пространственную структуру белка. Сущность метода состоит в том, что параметры а0 и Ьо, рассчитанные из данных по ДОВ

102

на основании уравнений Моффита — Янга для сложной дисперсии, записы­ вают в виде следующих линейных комбинаций:

где xR, хН, ж3 — доля различных конформаций (статистического клубка, а- спирали, [(-структуры) в структуре данного белка; aR, а®, ag — значения параметра а0 для структур, целиком состоящих из статистического клубка, а-спирали и (5-структуры соответственно; bR, bR , 63 — обычно принимаемые значения параметра Ъп для структур, целиком состоящих из статистического

клубка, а-спирали и [5-структуры. Так как по условию

то, решая систему этих трех уравнений, можно найти численные значения xR, хн , ж3 для исследуемого белка.

Была проверена применимость изложенного выше метода расче­ та вклада различных конформаций во вторичную структуру белка на таком хорошо изученном белке, как лизоцим. Использовались значения параметров а0и Ь0для лизоцима, рассчитанные из урав­ нения Мофитта — Янга на основании экспериментальных данных, полученных для водных растворов лизоцима и его растворов в 8 М водном растворе мочевины. Значения параметров а0 = —356 и

Ь„ = —155 для водных растворов лизоцима и% = —312 и 4 = О для растворов его в 8 М растворе мочевины использовались для расчета содержания различных конформаций по методу [248]. В

связи с тем что Ьд для лизоцима равно нулю, система трех урав­ нений после ряда последовательных преобразований сводилась к следующим выражениям:

= —680, что было найдено из оптического вращения чисто спираль­ ных форм. Используя для расчета приведенное выше уравнение и

полагая в нем ag = —1950 и bg = 125 (что характеризует поли­ пептид поли-//-пролин, который в литературе принято считать эта­ лоном (3-структуры), рассчитали следующие значения для содержа­ ния а-спирали, (3-структуры и «статистического клубка» во вторич­ ной структуре лизоцима: 27% а-спирали, 12% (3-структуры и ~ 61 % «статистического клубка».

103

Филлипсом [250] на основании данных рентгеноструктурного анализа приводятся такие значения для лизоцима: 35% спирализованной структуры (под спирализацией структур подразумева­ ется не только а-спираль), 10% ^-структуры, 55% «статистичес­ кого клубка».

Как видно из сравнения данных с имеющимися в литературе, используемый метод расчета [248] дает удовлетворительное сов­ падение результатов. Далее этот метод был применен для расчета содержания различных конформаций во вторичной структуре та­ кого белка, как казеин и его а- и (3-фракции. Измерения дисперсии оптического вращения казеина и его а- и p-фракций были проведе­ ны на автоматическом спектрополяриметре марки JASKO. ДОВ измерялась в интервале длин волн от 300 до 600 ммк. В работе ис­ пользовался препарат казеина, полученный по методу Хаммарстена [251]. Фракционирование казеина осуществлялось по методу Хиппа с применением мочевины [252]. Растворы казеина готови­ лись на бидистилляте, казеин растворяли в растворе NaOH, pH всех исследованных растворов был 10,5. Концентрации растворов казеина находились в пределах от 0,4 до 0,6 г/100 мл раствора. Экспериментальные данные обрабатывались по уравнению Моффита — Янга для сложной дисперсии.

Значения параметров а0и Ь0для казеина и его а- и Р-фракций определялись графически. Для всех растворов казеина измерения ДОВ были проведены при температурах 20 и 50° С. Для проведения прямых линий пользовались методом наименьших квадратов. Ре­ зультаты расчета экспериментальных данных по уравнению Моф-

Полученные значения а0 и Ь0 (см. табл. 5) использовались для

расчета значений xR, х11, х$. Значения величин а” , я?, а§, bf, b$, Ь%, которые необходимы для решения системы трех уравнений с тремя неизвестными, а следовательно, и для расчета величин xR, xR, ж*3, были взяты' из литературных данных и приводятся в табл. 6 с ука­ занием литературного источника.

104

Значения а?, равные —604, —620 и —530° для нефракциониро-

Они были получены для растворов казеина в 6 М растворе мочеви­ ны — растворителя, способствующего образованию конформации

статистического клубка. Значения bR для всех растворов казеинов были найдены равными 0; 0;—60, что также характерно для Ста­

тистического клубка. Значения a f = —680 и bR = —630 были взяты в качестве эталонных значений параметров я0 и Ь0для чисто спиральных (а-спираль) конформаций структур белков, так как в литературе принято характеризовать оптическое вращение чисто

оптическому вращению для полипептидов поли-1,-пролина, кото­ рые в литературе [238] принято считать за эталонные для [3-струк­ туры.

После подстановки приведенных выше значений параметров

которая в случае bR = 0 (см. табл. 6) превращается в систему урав­ нений (20)—(22). В случае нефракционированного а- и (3-казеинов

105

соответствующие им значения а$ и берут из табл. 6. Подставляя экспериментально полученные значения а0и &0 в уравнения данной системы [или в уравнения (20) — (22)] и решая эти системы, полу­ чают значения xR, хн , зР (табл. 7).

Таким образом, расчет содержания различных конформаций в водных растворах казеина и а- и Р-казеинов на основании данных по ДОВ показал, что казеин и его фракции при 20 и 50° С и pH 10,5 в основном находятся в конформации статистического клубка и лишь небольшая доля —в конформации а-спирали и p-структуры

Процессы гелеобразования белков обычно сопровождаются кон- ) формационными изменениями молекул. По пи в олнойшз приведен­ ных работ, посвященных изучению конформационного состояния

казеинов,_не было проведено систематического исследования ки­ нетики конформационных изменений казеинов в водных растворах, а также_влияния таких (БакторовТкак pH, темпеиатуйаТконцент- j рация белка, что важно при исследовании гелеобразования. Кроме 1того, данные по шшянию температуры на конформацию макро­ молекул казеинов противоречивы, а данные по влиянию концентра­ ции на оптическое вращение и изменение его во времени отсут­

ствуют.

В связи с этим в наших работах [253, 254] исследовались конформационные изменения молекул казеина и его а- и ^-фракций при различных условиях. Из рис. 27 видно, что удельное оптиче­ ское вращение всех трех казеинов со временем уменьшается, при­ чем основные изменения происходят в течение 2—3 суток и закан­ чиваются через 4—5 суток. При дальнейшем стоянии растворы мутнеют. Кроме того, удельное оптическое вращение уменьшается и с увеличением концентрации казеинов в растворе, как это видно из рис. 28. Характер зависимости удельного оптического вращения растворов казеинов от времени и концентрации может свиде­ тельствовать о протекании процессов агрегации с повышением

106

концентраций растворов казеина. На возможность такого рода агрегации указано в работе Карпентера [255].

Так как гелеобразование наблюдается в определенном диапазо­ не pH, то исследовались изменения удельного оптического враще­ ния при pH от 6,5 до 13. Результаты представлены на рис. 29. Из сравнения результатов видно, что с увеличением pH удельное оп­ тическое вращение растет, достигая максимального значения при pH 12—13, что обусловлено развертыванием полипептидных цепей по мере накопления отрицательных зарядов на молекулах казеина. Для а-казеина и целого казеина при pH выше 12 происходит умень­ шение удельного оптического вращения. Это уменьшение, очевид­ но, связано с тем, что при большем избытке щелочь начинает взаи­ модействовать со свободными кислотными группами глутаминовой кислоты с образованием соли, что и приводит к изменению опти­ ческой активности [256—259].

Изучение зависимости удельного оптического вращения раст­ воров казеина от температуры также позволяет проследить изме­ нение конформации молекул казеина в водных растворах. Исследо­ вание проводилось в интервале температур 5—50° С. Температура повышалась со скоростью 1° за 10 мин. Измерения проводились через 5 суток, т. е. к тому времени, когда заканчиваются все про­ цессы, связанные с конформационными изменениями. Из рис. 30 видно, что с увеличением температуры удельное оптическое враще­ ние растворов всех трех казеинов уменьшается. Эта температурная зависимость обратима — при охлаждении от 50 до 5° G растворы вновь показывают высокое отрицательное значение. Следователь­ но, конформационные изменения молекул казеина тоже обратимы. Для определения энтальпии перехода упорядоченных участков (а-спираль и P-структура) казеина в статистический клубок были

лись значения AiT-перехода. Расчеты показали, что для Р-казеина АН = —32 ккал/молъ, а для нефракционированного и а-казеинов АН = —34 ккал/молъ. Это указывает на большую роль водородных связей в скреплении упорядоченных участков макромолекул ка­ зеинов.

Обнаруженная зависимость удельного оптического вращения от температуры для казеинов может быть объяснена следующим обра­ зом. Во-первых, вследствие высокого содержания пролина а- и Р-казеин, так же как и поли-Ь-пролин II, обладает коллагенопо­ добным типом скручивания полипептидных цепей. Поэтому раст­ воры казеина напоминают желатину, хотя по абсолютной величине

изменения [а]д с температурой значительно меньше. Для казеина нельзя говорить о спиральности в полном смысле, однако некото­ рые спирализованные участки в нем, как было нами показано, су­ ществуют, и тогда при повышении температуры происходит пере­ ход от упорядоченной структуры к конформации клубка. Вовторых, из-за высокого содержания пролина гидрофобные связи не

108

могут способствовать ос-СПиральной конформации и проявляются й межмолекулярных реакциях казеина, т. е. в агрегации при повы­ шении температуры. Оба предположения широко обсуждаются в литературе [234, 235, 238, 239].

Определение размеров частиц

вводных дисперсиях казеина методами светорассеяния

Вработе [260] размеры частиц в водных дисперсиях казеина определялись двумя независимыми методами: методом светорас­ сеяния (обработка экспериментальных данных по методу двойной экстраполяции) [261, 262] и по исследованию зависимости оптиче­ ской плотности непоглощающих систем от длины волны (в литера­ туре этот метод часто называют «спектром мутности», хотя правиль­ нее было бы называть его дисперсией светорассеяния). Этот метод представляет собой развитие теории Ми [263, 264] и усовершенст­ вован в настоящее время в работах Кленина и сотр. [171, 174, 265].

По методу двойной экстраполяции (метод Зимма) необходимо измерять полное угловое распределение интенсивности светорассеяния 1{(] для ряда

концентраций ец на основании определения инкремента показателя прелом­ ления раствора dn/dc и показателя преломления растворителя п рассчиты­

вают константу

2я2 (dn/dc)2n.Q

для данной длины волны Я и строят график зависимости Kc/Rв от сложного аргумента sin2 0/2 -f- кс (где к — масштабная константа). Точка пересечения

двух экстраполяционных кривых (при с = 0 и 0 = 0) отсекает начальную ординату А 0 — величину, обратную средневесовому молекулярному весу:

Наклон S 0 предельной линии при нулевой концентрации дает средний квад­

ратичный радиус инерции частицы

где Я0/га0 — длина световой волны в данной среде.

В тех случаях, когда двойная экстраполяция графиков Зимма затрудне­ на (полидисперсность системы, большие молекулярные веса и размеры ча­ стиц) прибегают к методу Янга [266]. При этом график строится в коорди­ натах

Молекулярные веса и размеры находят по следующим формулам.

109