книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

и пересыщенные растворы низкомолекулярных веществ. Некото­ рые из этих методов основаны на изменении термодинамических параметров (температуры, концентрации, давления) стабильных растворов в таком направлении, чтобы они перешли в область метастабильных состояний.

В большинстве исследований, посвященных проблемам «застуд­ невания», изучался только один метод — изменение температуры. В системах с верхней критической точкой смешения пересы­ щенные растворы могут быть получены быстрым охлаждением стабильных растворов. В системах с нижней критической точкой пересыщенные растворы получаются при повышении темпера­

туры.

Превращение метастабильных (пересыщенных) растворов в ста­ бильные равновесные фазы может протекать с самыми разнообраз­ ными скоростями и заканчиваться в различные сроки — от долей секунды до многих суток и недель. Важнейшим параметром, опре­ деляющим скорость разделения на две фазы, является степень пересыщения, а также подвижность макромолекул в данной системе, характеризуемая коэффициентом диффузии и, в какой-то степени, вязкостью. Разделение гомогенного метастабильного раствора на две фазы протекает, по-видимому, не путем возникно­ вения зародышей двух «готовых» новых фаз и последующего их конкурирующего роста, но путем возникновения в исходном растворе вначале множества весьма малых областей, лишь незна­ чительно отличающихся друг от друга по концентрации, пред­ ставляющих собой неравновесные участки раствора, способные сливаться друг с другом и постепенно приближаться к равновес­ ному состоянию. То обстоятельство, что обе возникающие фазы обычно вначале представляют собой жидкости, лишь слегка разли­ чающиеся по составу и имеющие небольшое межфазное натяжение, в значительной степени определяет характер образующихся гете­ рогенных систем.

Если жидкое, вязкотекучее состояние сохраняется обеими фа­ зами вплоть до установления равновесия, то начавшееся помутне­ ние метастабильного раствора (возникновение областей, разли­ чающихся по показателю преломления) приводит к образованию микроскопических капелек одной из фаз, взвешенных в непрерыв­ ной другой фазе. Возрастающее по мере приближения концентра­ ций к равновесным межфазное натяжение придает каплям сферическую форму, обеспечивающую минимум свободной поверх­ ностной энергии. Такие микроскопические капельки концентри­ рованных растворов высокомолекулярных соединений («коацерваты») или, напротив, разбавленных растворов в концентрирован­ ных средах («вакуоли») с течением времени в жидких средах могут коалесцировать, что приводит к разделению метастабиль­ ного раствора на два макроскопических жидких слоя. Равновесие в таких системах устанавливается особенно быстро и полно, поэтому разделение метастабильных растворов на две жидкие

60

фазы широко используется для фракционирования природных

исинтетических высокомолекулярных соединений.

Внекоторых случаях капли новой концентрированной поли­ мерной фазы быстро переходят в стеклообразное состояние. При этом образуются дисперсии, состоящие из довольно правильных сферических частичек. В большинстве случаев выделившиеся сфе­ рические капли новой концентрированной полимерной фазы переходят в текучее состояние постепенно, причем частично коа­ лесцируют, успевают срастись друг с другом и, затвердевая, образуют гроздевидные или сетчатые агрегаты — флокулы (хлопья).

Выделение новой фазы из метастабильных растворов кристал­ лизующихся полимеров протекает во многом аналогично кристал­ лизации низкомолекулярных веществ. При достаточно высоком пересыщении зародыши новой кристаллической фазы (т. е. доста­ точно большие флуктуации анизотропии и концентрации) могут возникать в объеме раствора, но часто более вероятным оказывает­ ся образование двухмерных зародышей на поверхности дисперс­ ных примесей. Скорость образования зародышей определяет скорость всего процесса кристаллизации. Рост пересыщения раствора или переохлаждения расплава повышает вероятность образования зародышей новой фазы лишь до определенного пре­ дела. По мере приближения к температуре стеклования подвиж­ ность молекул снижается, любые перегруппировки их тормозятся

искорость кристаллизации сильно уменьшается.

Выделение новой кристаллической фазы из метастабильных растворов и расплавов полимеров часто требует значительных «индукционных периодов» (в течение которых кристаллизация не наблюдается). Скорость роста возникших кристаллических частиц обычно невелика. Кристаллизация из расплавов остается неза­ вершенной в течение весьма длительных отрезков времени. При достаточно высокой концентрации полимера в исходном метастабильном растворе процессы разделения на две фазы (при условии, что они происходят при отсутствии перемешивания) приводят к образованию нетекучих дисперсных конденсационных структур.

Следует заметить, что достаточно прочные, необратимо разру­ шающиеся высокомолекулярные дисперсные структуры могут возникать не только при процессах образования новой дисперсной фазы. Дисперсные структуры, возникающие при коагуляции кол­ лоидных дисперсий высокомолекулярных соединений (например, латексов, казеина), часто обладают свойствами, сходными со свойствами конденсационных структур. Это объясняется тем, что лабильные коагуляционные контакты между частицами полимер­ ной фазы (обладающей высокоэластическими и, в некоторой степе­ ни, пластическими свойствами) постепенно заменяются более прочными (и необратимо разрушающимися) фазовыми контактами.

Гели и студни различной природы были с давних пор предме­ том изучения в физической и коллоидной химии. Возникновение

61

в структуре каркаса обусловливает специфические механические свойства гелей, такие как прочность, обратимая деформация, отсутствие течения, эластичность. Однако характер этой возник­ шей сетки, природа связей и контактов, механизм гелеобразования и термодинамические свойства гелей являются до сих пор предме­ том изучения многих исследователей.

Пайков и сотр. [42—51] определяют студни (гели) как много- . компонентные системы, которые характеризуются двумя основными признаками — высокой обратимой деформацией и практическим отсутствием текучести, и выделяет два главных типа таких систем с участием полимерного компонента.

Первый тип — студни, образующиеся при набухании сшитых полимеров или при сшивке макромолекул в растворе. Пространст­ венный каркас таких студней состоит из сотни макромолекул, отрезки которых между точками химических сшивок способны к изменению конформации под действием прилагаемых напряже­ ний. Обратимость деформации таких систем носит в основном энтропийный характер, а отсутствие течения при умеренных напряжениях обусловлено высокой энергией химической связи.’ Эти системы можно рассматривать как однофазные в пределах их равновесного набухания. Если же при образовании таких студней из растворов равновесный объем набухания оказывается меньшим, чем объем исходного раствора, то наблюдается или «микросинерезис», обнаруживаемый по опалесценции системы, или «макросинерезис» с отделением части растворителя. Подобные системы становятся двухфазными.

Второй тип — студни, возникающие в результате распада однофазного раствора полимера на две фазы при изменении температуры или состава растворителя. Незавершенность расслое­ ния системы, обусловленная очень высокой вязкостью одной из разновесных фаз (высококонцентрированной по полимеру), при­ водит к образованию каркаса из этой фазы, в который включены субмикроучастки низковязкой фазы (низкоконцентрированной по полимеру). Благодаря высокой концентрации полимера «каркас­ ной» фазы и вследствие малой протяженности элементов этого каркаса в одном из измерении (по аналогии с пенами), свойства этих элементов каркаса приближаются к свойствам твердого тела. Обратимая деформация систем связана здесь с упругим изгибом элементов каркаса, а энтропия мало изменяется. Обратимость застудневания в таких системах обусловлена переходом от двух­ фазного к однофазному состоянию и наоборот. Студни второго типа во всех случаях двухфазные системы. Они с большей или меньшей скоростью синерезируют, однако полное разделение сосуществующих фаз практически никогда не достигается.

В работах Гликмана и сотр. [52—57] гели полимеров рассмат­ риваются как двухфазные многокомпонентные системы, в которых нерастворимые в данных термодинамических условиях фракции образуют состоящую из переплетающихся пучков макромолекул

62

сетку-каркас геля. Эта сетка охватывает и лишает текучести раствор других полимергомологов, которые, так же как и моле­ кулы растворителя, в той или иной мере связаны с каркасом энергетически (адсорбция, сольватация). При изменении темпера­ туры или состава растворителя из раствора полимера, неоднород­ ного в отношении степени полимеризации и химических особенно­ стей макромолекул, последовательно выделяются нерастворимые в изменившихся условиях фракции.

Гембицкому, Аверьяновой, Хомутову и сотр. [57, 58] удалось подтвердить и развить высказанную точку зрения, применяя разнообразные физико-химические методы исследования (свето­ рассеяние, дилатометрию, механические испытания, спектро­ скопию, двойное лучепреломление, рентгенографию, дифферен­ циальный термический анализ и др.).

Зубов, Журкина и Каргин с сотр. [59] охарактеризовали студни как переходное состояние двухкомпонентной системы (полимер — растворитель) с резким увеличением вязкости и потерей текучести. Процесс студнеобразования связан с возникновением локальных связей между отдельными молекулами или между надмолекуляр­ ными структурами по всему объему системы с возникновением сетчатой структуры. При этом надмолекулярные структуры могут быть частицами новой фазы концентрированного полимера в раз­ бавленном растворе полимера. Авторы [59] классифицировали студни на разбавленные и концентрированные. Признаком разбавленного студня является наличие небольшого количества локальных связей (узлов сетки), отсутствие взаимодействия между цепными участ­ ками и связанные с этим малые периоды релаксации. Признаком концентрированного студня является сильное взаимодействие меж­ ду участками цепей, определяющее их релаксационные свойства, давая набор как малых, так и больших периодов релаксации.

В работах Меерсон и Липатова [60—63] рассмотрено влияние фазового и физического состояния полимеров на свойства студней. Проведены систематические исследования явлений ограничен­ ного набухания полимеров и застудневания их растворов в плохих растворителях. Впервые было высказано предположение о влиянии на свойства студней, кроме концентрации, природы полимера и растворителя, также фазового и физического состояний полиме­ ров, их способности к кристаллизации и стеклованию.

При изучении процессов образования новых дисперсных фаз, играющих решающую роль в формировании высокомолекулярных конденсационных структур,— студней или гелей большая роль отводится исследованию различных физико-химических свойств этих структур методами светорассеяния, малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, а также электронной микроскопии, которые позволяют установить объективные различия между гомогенными, однофазными и гетерогенными двухфазными системами.

В работах Влодавца и сотр. [14—20] особое значение отводится высокомолекулярным конденсационным структурам, возникаю-

63

Ш,им в результате выделения Новых дисперсных фаз из метастабильных (пересыщенных) растворов высокомолекулярных соединений— сетчатым конденсационным структурам первого рода, в которых обе фазы непрерывны, и ячеистым конденсационным структурам второго рода, в которых непрерывна только конденсированная полимерная фаза. Влодавец подчеркивает большую роль поверх­ ностных явлений на границах раздела фаз, что проявляется в спо­ собности высокомолекулярных дисперсных структур к капилляр­ ной контракции при испарении жидкой фазы, к развитию в них внутренних (усадочных) напряжений и к превращению в крипто­ гетерогенные материалы.

Пористая структура полимерных материалов существенным образом зависит от способа образования структуры. Пленки, полученные изотермическим испарением растворителя без перевода системы в область образования двухфазной структуры, существен­ но отличаются от пленок, полученных из двухфазных систем. Первые характеризуются малой пористостью и небольшой сте­ пенью набухания с сохранением однофазпости, вторые — более высокой степенью набухания [14, 44, 45].

Френкель и сотр. [21] обобщают работы по фазовым равно­ весиям в системе полимер—растворитель и дают термодинами­ ческий критерий концентрированных и разбавленных растворов. Было предложено рассматривать фазовые диаграммы в двух при­ ближениях. Первое равновесное приближение позволяет лишь в общих чертах предсказать характер структуры на любом участке системы. Такое рассмотрение основано на полной аналогии между простыми бинарными смесями и растворами полимеров в низко­ молекулярных жидкостях. Сущность аналогии заключается в том, что хотя и принимается во внимание принципиальное различие

Второе, неравновесное приближение учитывает не рассматри­ ваемые в статистико-механических теориях факторы структурной релаксации. При этом вопрос о формировании дискретных и сетчатых структур в растворах и о температурно-концентрацион­ ных областях их длительного существования решается в значи­ тельной мере в зависимости от того, каким способом достигается соответствующая точка фазовой диаграммы. Из-за больших раз­ меров макромолекул и соответственно огромных времен релакса­ ции даже в области полной совместимости могут существовать равновесные и неравновесные надмолекулярные структуры, как дискретные, так и типа аморфных сеток, что было эксперименталь­ но доказано в работах [30, 31]. Выделение макроскопической фазы полимера происходило с сохранением надмолекулярной морфоло­ гии структур, уже возникших непосредственно в растворах и рас­ плавах полимеров. Вопрос о фазовом характере сеток, получаю­ щихся при разделении системы па две фазы, решается рассмотре-

64

пием на фазовой диаграмме взаимного расположения верхней критической температуры смешения (выше этой температуры система однофазна) и температуры стеклования. Выше верхней критической температуры смешения может существовать только концентрированный стеклообразный раствор; ниже ее при опре­ деленных соотношениях температуры и концентрации полимера может возникнуть гель, т. е. двухфазная система.

Витоге рассмотрения работ, посвященных фазовому составу

всистемах полимер—растворитель, следует отметить, что, несмот­ ря на всю важность определения фазового состава гелей, пред­ ставления о фазовом расслоении в системе недостаточно для понимания механизма образования гелей. К сожалению, до сих пор вопрос о механизме возникновения и кинетике развития пространственных белковых и полимерных структур не подвер­

гался физико-химическому изучению. Эти вопросы могут быть решены с позиций физико-химической механики.

Основной задачей физико-химической механики является полу­ чение дисперсных Структур с заданными механическими свойст­ вами. Эта задача решается с помощью изучения физико-химических закономерностей и механизма процессов структурообразования в различных условиях развития пространственных структур с заданными механическими свойствами. Процессы возникновения и разрушения структур протекают во времени, и для управления этими процессами плодотворным оказалось изучение именно кине­ тических закономерностей. Эта задача физико-химической механи­ ки в значительной степени связана с теорией образования новых дисперсных фаз из пересыщенного раствора как жидкой диспер­ сионной среды. Для управления процессом структурообразования

ние связано с образованием новой дисперсной фазы.

При исследовании гелей белков и полимеров уделялось значи­ тельное внимание изучению физико-химических и механических свойств уже сформированных структур и практически не рас­ сматривались процессы зарождения и формирования простран­ ственных структур, в частности образования новых дисперсных фаз. Механизм структурообразования в белковых и полимерных системах до сих пор недостаточно изучен с этой точки зрения. Кроме того, констатирование фазового расслоения в системе не является признаком структурообразования, так как выделение новой фазы не обязательно приводит к возникновению прочной пространственной структуры.

Во второй главе монографии представлены результаты исследо­ вания механизма объемного структурообразования в водных растворах и дисперсия белков на основе представлений физико­ химической механики дисперсных систем.

С Т Р У К Т У Р О О Б Р А ЗО В А Н И Е В Г Е Л Я Х Ж Е Л А Т И Н Ы

Гели желатины находят широкое применение в промышлен­ ности и представляют интерес как для физико-химиков, так и био­ логов, позволяя подойти к раскрытию механизма образования биологически важных систем. Их исследованию посвящено много работ, среди которых известные монографии Вейса [64] и Каналь­ ского [65], обзорные статьи Дж. Ферри [66], Липатова и Прошляковой [67], Лабудзинской и сотр. [68].

Гели желатины исследовались разнообразными физико-хими­ ческими методами: вискозиметрии [69], термохимии [70, 71], оптического вращения [72—76], светорассеяния [77], электрон­ ной микроскопии [78—80], ядерного магнитного резонанса [81, 82], седиментации в ультрацентрифуге [83, 84], электрофореза, флюоресценции [85], реологическими [86—90]. Однако все иссле­ дования ограничивались рассмотрением уже сформированных структур.

Для выяснения механизма гелеобразования желатины нами применялся кинетический подход, принятый в физико-химической механике. Процесс структурообразования гелей желатины иссле­ довался на разных уровнях организации макромолекул. Конформационные изменения изучались поляриметрическим методом, фазовые превращения — калориметрическим методом и методом светорассеяния, возникновение трехмерной структуры характери­ зовали по предельному напряжению сдвига.

Изучение конформационного состояния макромолекул желатины поляриметрическим методом

Конформационные переходы макромолекул желатины легко проследить по изменению оптического вращения [91]. Для колла­ гена и желатины упорядоченное состояние молекул соответст­ вует более высоким отрицательным значениям оптического вра­ щения, тогда как неупорядоченное характеризуется меньшей величиной левовращения. Процесс образования макромолекул с упорядоченными структурированными участками в растворах желатины происходит во времени, что позволяет изучать кине­ тику этого перехода:

где а — измеряемый угол поворота плоскости поляризованного света при данной длине волны и температуре; I —■длина кюветы, дм; с — концентрация исследуемого раствора в з/100 мл раствора.

Для работы целесообразно использовать термостатируемые поляриметрические кюветы различной длины, колебания тем­ пературы не должны превышать 0,05° С.

66

Скорость накопления коллагеноподобных участков в водных расворах желатины существенно зависит от концентрации белка. Однако предельные величины удельного вращения при определен­ ной температуре не зависят от исходной концентрации белка в растворе для мало концентрированных систем (до 10% белка) (рис. 1).

Возрастание скорости изменения [а]1 с увеличением концен­ трации белка в растворах позволяет считать, что этот процесс определяется в основном межмолекулярными взаимодействиями, а не образованием индивидуальной спирали, стабилизованной внутримолекулярными связями. Скорость процесса при этом оп­ ределяется увеличивающейся с ростом концентрации вероятностью эффективных столкновений молекул в растворе желатины. Эф­ фективными, очевидно, будут столкновения, приводящие к об­ разованию участка с коллагеноподобной тройной спиралью, образованной взаимодействием трех полипептидных цепей.

Рис. 1. Изменение удельного -м™ оптического вращения раство­

ров и гелей желатины во вре­ мени для различных концен­ траций и температур (pH 4,9)

а — 4° С; б — 16° С; в — 24° С.

1 — 0,05; 2 — 0,3; 3 — 0,5; 4 — 1,0; 5 — 3,0 г/100 мл

Рис. 2. Зависимость темпера­ турного коэффициента удель­ ного оптического вращения ра­ створов и гелей желатины в изоэлектрическом состоянии от температуры

1 — 0,5; 2 — 2,0; 3 — 5,0 г/100 мл

3* 67

Зависимость скорости конформационного перехода от кон­ центрации желатины, а также увеличение скорости с увеличе­ нием молекулярного веса желатины позволяют думать, что число участков, в которых способна зарождаться тройная спираль, в этих условиях достаточно велико. Участки тройной спирали могут сохраняться при смещении трех индивидуальных цепей друг относительно друга в молекуле нативного коллагена. Однако величины удельного левовращения в растворах и гелях желатины после ренатурации всегда ниже значений, характерных для растворов нативного коллагена, вследствие того, что некоторая часть каждой цепи остается неупорядоченной. Этот вывод со­ гласуется с данными работы Коэна [75] и объясняет некоторое специфическое поведение растворов и гелей желатины.

Однако в образовании коллагеноподобных структур могут принимать участие не только сегменты трех отдельных цепей. Оставшиеся свободными части этих полипептидных цепей в свою очередь могут спирализоваться с фрагментами других цепей, чтов конце концов приводит к образованию в растворе агрегатов, связанных пространственно участками коллагеноподобных трой­ ных спиралей. Это объясняет, почему в холодных растворах раз­ личных желатин не обнаруживаются высокоасимметричные об­ разования (в отличие от растворов нативного коллагена) или отдельные полимерные цепи, а всегда присутствуют крупные симметричные агрегаты, быстро образующиеся при охлаждении исходного раствора и практически не диссоциирующие при раз­

бавлении [77].

Такие агрегаты и ранее рассматривались как микрогели и предполагалось, что стабилизированы они так же, как гели жела­ тины. Для выяснения особенностей перехода спираль — клубок в гелеобразующих системах желатины были проведены исследо­ вания при концентрациях желатины больше 2 г/100 мл, т. е. в условиях гелеобразования [92]. На рис. 2 представлены кривые зависимости температурных коэффициентов удельного оптического вращения растворов и гелей желатины от температуры. Видно, что при 36° С и выше температурный коэффициент удельного оптического вращения равен нулю. В этой области существуют лишь молекулы желатины в конформации статистического клуб­ ка. При охлаждении до 20° скорость образования спиралей уве­ личивается, при 17—20° С температурный коэффициент удельного оптического вращения наибольший и постоянный, а затем он уменьшается. По-видимому, это связано с уменьшением подвиж­ ности молекул и их сегментов при снижении температуры, что затрудняет образование спиральных конформаций и с тем, что наибольшая доля молекул желатины из конформаций статисти­ ческого клубка уже перешла в спиральную конформацию.

Из рис. 2 также видно, что максимальные температурные коэффициенты удельного оптического вращения гелей и раство­ ров желатины совпадают. Это свидетельствует о том, что в изу­

68

ченном интервале концентраций (до 5 г/100 мл) конформационный переход спираль — статистический клубок не зависит от того, находятся ли молекулы в растворе или участвуют в образовании структуры геля. Исследование изменения удельного оптического вращения в более концентрированных системах экспериментально затруднено. Хорошо известно, что многие физико-химические и биологические свойства нативных белковых молекул, а также синтетических полимеров в сильной степени зависят от кислотно­ щелочного равновесия. Известна, например, очень интересная зависимость оптического вращения водных растворов желатины

Рис. 3. Зависимость удельного оптического вращения от pH раствора желатины

а — концентрация желатины 0,5 г/100 мл\ 6 — 5 г/100 мл. 1 — 30°; 2 — 20°; з — 10° С

от pH. Однако имеющиеся в литературе данные [76] не позволяют однозначно объяснить эту зависимость.

Влияние pH среды на оптическую активность растворов и гелей желатины при различных температурах представлено на рис. 3, а и б. При 30° С и выше удельное оптическое вращение мало зависит от pH и ионной силы раствора и обусловлено только наличием асимметрических атомов углерода в молекуле желатины. Кривые зависимости удельного оптического вращения от pH при пониженных температурах имели максимум при pH 5 и минимум при pH 3. Уменьшение удельного оптического вращения при изменении pH в обе стороны от изоэлектрической точки указы­ вает на нарушение внутримолекулярной структуры желатины. Причиной нарушения спиральной структуры молекулы является электростатическое отталкивание одноименных зарядов молекулы. Это подтверждается опытами, проведенными в присутствии солей.

69