книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

макромолекул. Большая плотность зарядов макромолекул умень­ шает адсорбцию и не способствует образованию межмолекулярных связей, хотя, по данным изменения вязкости и удельного оптиче­ ского вращения, степень развертывания макромолекул возра­ стает [146].

Для выяснения структуры межфазных адсорбционных слоев, образованных глобулярными белками, изучалось образование межфазных слоев на жидких границах раздела фаз при различных

Рис. 33. Зависимость прочности межфазных адсорбционных'/слоев на границе водный раствор яич­ ного альбумина/бензол от pH при различных условиях опытов

Рис. 34. Зависимость прочности межфазного слоя яичного альбу­ мина (1) на границе с бензолом

и времени жизни капель бензола

Рис. 35. Зависимость прочности межфазного адсорбционного слоя и удельного оптического враще­ ния на границе водный раствор а-казеина/бензол от pH раствора

(с = 1,5 г/100 мл, 20° С)

товления растворов

210

концентрациях в растворах яичного и сывороточного альбуминов и казеина. На рис. 37 и 38 представлены зависимости прочности межфазных слоев от концентрации казеина и сывороточного аль­ бумина. Для всех глобулярных белков существуют максимумы на кривых зависимости Ра от концентрации белка, лежащие, однако, в разных областях концентраций. Зависимости, аналогичные пред­ ставленным на рис. 37 и 38, получены и для растворов лизоцима.

Измерения времени жизни капель бензола на границах раздела фаз показали очень большие времена жизни (Ту, 3 час) при 22

Рис. 36. Зависимость абсолютной величины заряда Z (1) [145], при­

веденной вязкости т]/с(2), поверх­ ностного натяжения (3), удельно­ го оптического вращения (4)

и прочности межфазного слоя (5) водных растворов ЧСА на границе с бензолом от pH при 20° С

Рис. 37. Зависимость удельного оптического вращения водных растворов а-казеина (1), прочно­

сти межфазных адсорбционных слоев (2) и времени жизни эле­ ментарных капель (3) на грани­

це водный раствор а-казеина/бен- зол от концентрации белка

(pH 10,8; 20° С)

Рис. 38. Влияние концентрации ЧСА в водных растворах на проч­ ность межфазных адсорбционных слоев на границе с воздухом (1) и

с бензолом (2); на поверхностное натяжение на границе с воздухом

(3) и с н-октадеканом (4)- на из­

менение энтропии на границе вод­ ный раствор ЧСА/71-октадекан (5)

211

и 55° Сдля всех концентраций водных растворов яичного альбумина:

Время жизни капель определялось после старения межфазного слоя в течение 2 час [147].

Безусловно, сдвиг максимальной прочности межфазных слоев по оси концентраций, наблюдаемый для различных белков, свя­ зан с особенностями структуры и поведения этих белков в водных растворах. Крупные ассоциаты казеина не способны к адсорб­ ции, их возникновение в объеме раствора эквивалентно уменьше­ нию концентрации поверхностно-активного компонента [149].

Прочность межфазного адсорбционного слоя на границах вод­ ного раствора ЧСА с воздухом и бензолом (см. рис. 38) с повыше­ нием концентрации ЧСА в области очень маленьких концентраций увеличивается, потом падает и при с ж 0,1 г/100 мл остается по­ стоянной. На этом же рисунке представлены равновесные значе­ ния поверхностного натяжения в зависимости от концентрации ЧСА в растворе. Из сопоставления данных по прочности межфаз­ ных слоев и поверхностному натяжению видно, что нарастание прочности связано со все возрастающей адсорбцией ЧСА, а паде­ ние наблюдается при неизменном значении поверхностного на­ тяжения, что обусловлено, очевидно, меньшей развертываемостью макромолекул на границе раздела фаз при дальнейшем увеличении концентрации.

Гош и Булл [148] считают, что при низких концентрациях сывороточного альбумина возрастание энтропии, возможно, свя­ зано с поверхностной денатурацией белка (см. рис. 38, кривая 1). При более высоких концентрациях ЧСА энтропийные изменения становятся отрицательными, что связано с процессом конденсиро­ вания белковой пленки на границе раздела фаз. Эти литератур­ ные данные подтверждают наличие резкого максимума межфаз­ ной прочности в области очень маленьких концентраций сыво­ роточного альбумина.

Как уже указывалось, образование адсорбционных межфаз­ ных слоев белков представляет собой комплексный процесс. На­ тивные молекулы (белки) диффундируют к поверхности, адсорби­ руются, претерпевают конформационные изменения и создают новые межфазные структуры. При высоких концентрациях белка в растворе диффузия велика и скорость образования прочных межфазных слоев определяется стадиями адсорбции, изменением конформационных состояний макромолекулы и образованием боль­ шого числа нековалентных межмолекулярных связей, обуслов­ ливающих прочность возникающих межфазных структур.

Рассмотрим, как зависит прочность межфазных адсорбционных слоев на жидкой границе вода/углеводород в присутствии водорастворимых и маслорастворимых поверхностно-активных до­ бавок. В качестве водорастворимого ПАВ можно использовать гло­

212

булярные белки, например сывороточный альбумин человека, а маслорастворимого — стеариновую кислоту. При образовании смешанного межфазного адсорбционного слоя величина P s воз­ растает в 2 раза (от 1,0 дин/см для системы 0,15 г/100 мл водный раствор ЧСА/бензол до 2,0 дин1см при добавлении к бензолу 0,005 молъ1л стеариновой кислоты, pH 5,2 при 18° С). Подобное увеличение межфазной прочности обусловлено образованием допол­ нительных связей при контактировании молекул, составляю­ щих смешанные адсорбционные слои.

К МЕХАНИЗМУ ОБРАЗОВАНИЯ МЕЖФАЗНЫХ АДСОРБЦИОННЫХ СЛОЕВ ВПАВ НА ЖИДКИХ ГРАНИЦАХ РАЗДЕЛА ФАЗ

Для установления механизма образования межфазных адсорб­ ционных слоев белков и других ВПАВ необходимо изучать явле­ ния на границе двух жидких фаз (воды и масла), содержащих ком­ поненты, способные образовывать двухмерные структуры, состав­ ляющие как бы особую поверхностную фазу.

Изучение механических свойств адсорбционных слоев оказа­ лось плодотворным для определения их структуры и конформационного состояния белков на границе раздела фаз. На границе раздела водный раствор/углеводород в результате адсорбции мак­ ромолекул белков или поверхностно-активных полимеров возника­ ет межфазный слой, обладающий высокой структурной прочностью.

Изучение зависимости прочности адсорбционного слоя от вре­ мени его образования показывает, что формирование адсорбцион­ ного слоя на границе раздела фаз для полимеров требует несколь­ ких часов в отличие от низкомолекулярных ПАВ, для которых образование равновесного адсорбционного слоя происходит прак­ тически мгновенно.

При высоких концентрациях полимеров скорость образования адсорбционного слоя несколько увеличивается. С этими результа­ тами хорошо согласуются литературные данные, по которым ми­ нимальное значение межфазного поверхностного натяжения вод­ ных растворов белков и полимеров на границе с предельным угле­ водородом достигается в течение нескольких часов [149]. Однако следует отметить, что равновесное значение поверхностного на­ тяжения, измеренное методом висящей капли, устанавливается раньше достижения предельного значения межфазной прочности. Например, для сывороточного альбумина, яичного альбумина и

слоях, чем метод измерения поверхностного натяжения. Постепенное нарастание межфазной прочности и адсорбции

макромолекул обусловлено замедленной диффузией адсорбирую-

213

хцихся макромолекул и медленной ориентацией их на границе раздела фаз. Отличие адсорбции высокомолекулярных соединений от адсорбции низкомолекулярных ПАВ заключается также и в том, что адсорбция полимерных молекул в целом необратима, тогда как адсорбция отдельных сегментов может быть обратимой [144, 150].

Рассмотрим сначала наиболее простой случай развития меж­ фазной прочности водных растворов глобулярных белков на гра­ нице с воздухом. Известно, что в водных растворах молекулы яичного альбумина, сывороточного альбумина и казеина находят­ ся в виде глобул и большинство неполярных групп создают гид­ рофобные области внутри глобулы. При адсорбции белка на по­ верхности в результате избытка свободной энергии на границе раздела фаз происходят конформационные изменения адсорбиро­ ванных молекул, так как нарушается равновесие сил, стабилизи­ рующих глобулу. Ранее на возможность развертывания глобул белков на границе раздела фаз указывалось в работах Александе­ ра [42, 43, 126], Пчелина [151], Деборина [152]. Развертывание макромолекул на границе раздела фаз сопровождается глубокими изменениями в третичной структуре, вследствие чего большинст­ во гидрофобных групп ориентировано к воздуху. Агрегация де­ натурированных макромолекул и обусловливает нарастание про­ чности межфазного адсорбционного слоя. Возникающий при аг­ регации макромолекул тип структуры, образованный множеством межмолекулярных гидрофобных связей, напоминает ^-структуру параллельного типа. Фришем, Симхой и Эйрихом [153—155] для разбавленных растворов полимеров была разработана модель структуры адсорбционного слоя, по которой гидрофобные участки макромолекул обращены в газовую фазу, тогда как остальная часть адсорбированной макромолекулы образует как бы свободные петли и складки. Эта модель также не исключает возможности образования межмолекулярных связей, приводящих к возникно­ вению межфазных прочных структур.

При исследовании прочности межфазных адсорбционных слоев полимеров на границе водный раствор/углеводород нами было об­ наружено новое свойство этих слоев, заключающееся в повыше­ нии прочности слоя на границе с углеводородом по сравнению с прочностью слоя на границе с воздухом. Для низкомолекулярных же ПАВ органическая жидкость (масло) сильно ослабляет ко­ гезию между углеводородными частями молекул в адсорбционном слое [156, 157], что вызывает обратное явление. Повышенное на 2—3 порядка значение прочности на границе с углеводородом можно рассматривать как результат более полной развернутости макро­ молекул полимеров и образования большего числа межмолекуляр­ ных связей. Известно [130, 131, 158, 159], что энтропия поверхност­ ной денатурации, гибкость, поверхностная вязкость и скачок по­ тенциала (поверхностный дипольный момент) на границе с маслом на порядок больше, чем на границе с воздухом. Эти данные яв­ ляются дополнительными доказательствами соответствующих раз­

214

личий в конформационном состоянии молекул белка на разных границах раздела фаз.

При изучении межфазных слоев, возникающих на границе вод­ ный раствор белка/углеводород, под микроскопом можно видеть морщины и складки, что указывает на значительные толщины адсорбционных слоев. Изучение времени жизни капель обнаружи­ ло полную корреляцию с результатами исследований прочности межфазных слоев. Совокупность проведенных исследований по­ зволяет предполагать, что межфазный слой является как бы особой поверхностной фазой, в которой в результате межмолекулярных взаимодействий макромолекул создаются упорядоченные области, напоминающие p-структуры.

Прочность адсорбционных межфазных слоев водных раство­ ров белков на границе с различными углеводородами неодинако­ ва. Нами была предпринята попытка объяснить это явление с учетом результатов исследования взаимодействия этих же угле­ водородов с белками в водном растворе (солюбилизации углеводо­ родов) [159, 160]. Было установлено, что взаимодействие белков с углеводородами в водных растворах является самопроизвольным обратимым процессом, механизм которого заключается в распреде­ лении углеводородов между неполярными областями макромо­ лекул белка и водой.

Для всех изученных белков солюбилизация углеводородов уменьшалась с увеличением молекулярного объема углеводорода. Было обнаружено соответствие между величиной солюбилизации углеводородов макромолекулами белка в водной фазе и прочностью межфазных адсорбционных слоев белка, возникающих на границе с этими углеводородами [144]. На границе с теми углеводородами, которые хорошо солюбилизируются, измеряемая прочность ад­ сорбционных слоев всегда выше. Солюбилизация углеводородов макромолекулами, приводящая в объеме раствора к образованию более компактных и более устойчивых к денатурации глобул, спо­ собствует большей развертываемости макромолекул белков на границе раздела фаз, и, следовательно, возникновению большей прочности на границе с этими же углеводородами.

Как было показано выше, при переходе к pH, далеким от изоэлектрической точки, заметно уменьшается скорость образования прочных межфазных слоев и иногда наблюдается некоторое умень­ шение предельной прочности. Увеличение ионной силы раствора приводило к повышению прочности межфазных слоев для всех изу­ ченных белков, что объясняется экранирующим действием ионов электролита по отношению к зарядам макромолекул. Изменения времени жизни элементарных капель углеводорода на тех же границах раздела фаз находятся в полном соответствии с из­ менениями прочности, определяемыми в тех же условиях.

Зависимости предельных прочностей межфазных адсорбцион­ ных слоев от концентрации позволяют разделить изученные био­ полимеры на две группы. Первая группа макромолекул (желати­

215

на при 40° С, ПВС, ПВФ 10%-ного замещения) обнаруживает вна­ чале увеличение прочности с концентрацией, однако выше неко­ торой определенной концентрации прочность возникающего ад­ сорбционного слоя не зависит от концентрации. Вторая группа макромолекул (сывороточный альбумин, лизоцим, казеин, ПВБ) вначале также показывает увеличение прочности межфазных ад­ сорбционных слоев, но выше определенной концентрации проч­ ность слоев резко уменьшается. Обращает на себя внимание, что эти две группы отличаются по конформационному состоянию мак­ ромолекул в водном растворе. Пространственные структуры мак­ ромолекул второй группы в большей степени стабилизованы внутримолекулярными гидрофобными связями. При больших кон­ центрациях макромолекул в растворе возникающий вначале меж­ фазный слой составлен из макромолекул, конформация которых практически не отличается от конформации в объеме водного ра­ створа. Высокая концентрация беспорядочных клубков (желати­ на, ПВС, ПВФ) в межфазном адсорбционном слое приводит к од­ новременному возникновению большого числа межмолекулярных нековалеНтных связей, что и является причиной образования про­ странственной структуры в межфазном слое. Предложенный ме­ ханизм образования межфазных пространственных структур на­ поминает процесс объемного структурообразования (гелеобразования) в водных растворах тех же макромолекул.

Ранее [161] при исследовании структурообразования в водных растворах белков было установлено, что образование прочных про­ странственных структур всегда связано с конформационными из­ менениями макромолекул, которые приводят к уменьшению раст­ воримости белковых молекул, возникновению агрегатов (частиц новой лиофильной фазы) и контактов между ними. Уменьшение прочности межфазного слоя полимеров второй группы с увеличе­ нием концентрации после достижения максимума происходит ли­ бо вследствие агрегирования макромолекул в растворе, либо в результате меньшей развертываемости макромолекул на границе раздела фаз. Агрегирование в растворе, обусловленное гидрофоб­ ными взаимодействиями неполярных участков макромолекул, приводит к существенному уменьшению их поверхностной актив­ ности и проявляется при концентрациях, значительно меньших, чем критическая концентрация гелеобразования в объеме.

Прочность смешанных межфазных адсорбционных слоев и время жизни капли углеводорода до коалесценции всегда гораздо больше, чем в случае отдельно взятых водорастворимых и масло­ растворимых поверхностно-активных добавок. ПАВ, растворен­ ные в углеводороде, ориентируются так, что их полярные группы направлены в сторону адсорбционных слоев белков, при этом воз­ можно образование дополнительных контактов как между поляр­ ными, так и гидрофобными группами обоих ПАВ (масло- и водо­ растворимых), что приводит к дополнительному структуриро­ ванию в адсорбционном слое. Поэтому прочность межфазных слоев

216

и время жйзнй элементарных капель на этих же грайицаХ раздела увеличиваются. Рассмотрим подробнее, какие типы взаимодейст­ вий могут возникать при образовании прочных межфазных ад­ сорбционных слоев белков и полимеров.

Прочность межфазных слоев поливинилового спирта и желати­ ны уменьшается с повышением температуры и при добавлении салицилата натрия. Это означает, что основными типами связей, скрепляющих пространственную структуру, оказываются во­ дородные связи. В случае глобулярных белков (вторая группа полимеров), у которых прочность межфазных адсорбционных слоев обусловлена в основном гидрофобными взаимодействиями, повышение температуры упрочняет возникающую структуру. Подобное влияние температуры и денатурирующих агентов на­ блюдалось и при исследовании объемного структурообразования в водных растворах рассмотренных полимеров. Таким образом, наблюдается полная аналогия механизмов образования прочных межфазных адсорбционных слоев и трехмерных (объемных) струк­ тур этих же высокомолекулярных ПАВ.

Знание преимущественного типа связи, вызывающего образо­ вание прочного межфазного слоя, позволяет управлять величиной прочности. Так, прочность межфазного слоя можно изменить, варьируя температуру. Можно повысить межфазную прочность, получая смешанные адсорбционные слои при добавлении ПАВ в масляную фазу.

РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МЕЖФАЗНЫХ АДСОРБЦИОННЫХ СЛОЕВ ВПАВ

Исследование реологических свойств межфазных адсорбцион­ ных слоев белков и поверхностно-активных полимеров представ­ ляет существенный интерес для решения биологических проблем, связанных с образованием и структурными функциями биомембран. Знание реологических характеристик межфазных адсорбционных слоев необходимо также для количественной оценки устойчивости к коалесценции концентрированных эмульсий, стабилизованных полимерами, в разных условиях эксплуатации.

Объектами исследования были выбраны полимеры, отличаю­ щиеся своим конформационным состоянием в водном растворе: поливиниловый спирт, макромолекулы которого в водном растворе представляют статистические клубки; желатина, имеющая кон­ формацию коллагеноподобной тройной спирали; сывороточный альбумин человека и лизоцим — глобулярные белки, имеющие сложный тип структуры, которая содержит а-спираль, [3-структуру и неупорядоченные области статистических клубков. Исследова­ нию подвергались адсорбционные слои водных растворов белков на границе с бензолом, сформированные в течение 5 —6 час при 20° С, достигшие предельного значения прочности и далее не из­ меняющиеся во времени.

217

В области малых напряжений сдвига изучалось развитие во времени деформаций сдвига при постоянном заданном напряжении в течение 60—70 мин и обратный спад деформаций после снятия нагрузки. В качестве примера на рис. 39 представлены кривые развития деформации во времени под постоянной нагрузкой и кривые спада деформации после снятия нагрузки для межфазного адсорбционного слоя, сформировавшегося на границе водного рас­ твора желатины (с = 0,1 — 0,5 г/100 мл) и бензола при комнат­ ной температуре. Интервал напряжений сдвига, в котором изуча­ лась деформация, составил 0,006 —0, 69дин1см. Сразу при наложе­ нии нагрузки в слое возникает условно-мгновенная деформация е0, которая растет с увеличением нагрузки (от 0,01 при нагрузке, равной 0,06 дин1см, до 0,09 при 0,57 дин/см). Условно-мгновенная деформация измерялась в первые 5 сек после наложения на систе­ му нагрузки. Далее за деформацией, возникающей мгновенно по­ сле наложения нагрузки, развиваются эластические деформации, растущие во времени. При нагрузках, больших 0,23 дин/см, в слое, помимо еще развивающихся эластических деформаций, возника­ ют остаточные деформации, развивающиеся с постоянной скоро­ стью. В слое довольно быстро устанавливается стационарное течение, скорость которого возрастает с увеличением напряжения сдвига Ps. О наличии в слое остаточных деформаций можно судить по кривой спада деформаций после снятия нагрузки. Кривые раз­ грузки повторяют ход кривых нагрузки. Величины условно-мгно­

упругого последействия 6 для межфазного адсорбционного слоя желатины (исходная концентрация желатины в водном растворе равна 0,3 а/100 мл). С увеличением Ps пропорционально растут

218