книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

При экстраполяции в области малых углов

М . Щ , ;

где S Qи т 0 — наклон и начальная ордината линии нулевой концентрации.

При экстраполяции в области больших углов

Измерения интенсивности светорассеяния проводили на приборе ФПС-2М при Я = 436 ммк; регистрировали интенсивность светорассеяния в интервале

углов 30 -ь 150°.

Метод дисперсии светорассеяния удобен при исследовании белковых растворов в случае, когда их мутность т обусловлена рассеянием света преимущественно крупными частицами.

Тогда зависимость т (Я) можно интерпретировать в рамках последних разработок теории Ми [171—174, 263], позволяющих определять размеры частиц без знания их концентрации.

В работе [260] на основании зависимости lg D от lg Я (О — оптическая

плотность растворов), которая в достаточно узком диапазоне длин волн вы­ ражается прямой, определялся наклон этой прямой — п, который является

сложной функцией размеров и относительного показателя преломления т. Значения п табулированы в работе Хеллера и сотр. [263]. Таким образом,

врастворе). В случае полидисперсности частиц определяют средневесовой радиус R w .

Оптическую плотность измеряли на приборе «Specord» в видимой области

впределах волновых чисел 14—28• 103 слГ1. Величину относительного пока­ зателя преломления т оценивали, полагая, что т = 1,52 — «показатель

преломления» сухого казеина, п0 = 1,33 для воды и п0 = 1,40 для 8 М вод­ ного раствора мочевины, откуда т = 1,1.

Казеин, полученный по методу Хаммарстена с зольностью 0,47% (со­ держание кальция 0,4%), дополнительно очищали от кальция многократ­ ным переосаждением по методике, предложенной Дьяченко и Влодавцем [267]. Растворы для измерения светорассеяния обеспыливали 4—5-кратным фильтрованием через бактериальный фильтр № 5 (с диаметром пор 1,62 мк).

В связи с тем что оба использованных метода применимы только в ус­ ловиях однократного рассеяния света, предварительно определяли концент­ рационные интервалы, в которых К“0»/с и Die не зависят от концентрации,

что является критерием отсутствия в системе вторичного рассеяния [263]. При этом оказалось, что в методе светорассеяния условия однократного рассеяния соблюдаются до с = 0,2 е/100 мл, а во втором методе до с — = 2,5 г/100 мл; это различие в чувствительности двух методов определяется

отличиями в оптических схемах приборов.

Измерение интенсивности светорассеяния во времени в течение суток показало неизменность для растворов казеина (pH 8,5) раз­ личных концентраций (с = 0,05=1,28 г/100 мл) в интервале 6— 35° С. Отсутствие кинетических закономерностей свидетельствует

110

об устойчивом и неизменном состоянии рассеивающих центров ка­ зеина при данных условиях.

На рис. 31 представлен график Зимма для растворов казеина в боратном буфере (pH 8,5) при 20° С. Рассчитанные средневесовой частичный вес и радиус инерции соответственно равны: M w = 4,1- •10е и (Eg)w = 1600 А. Таким образом, рассеивающие центры в растворе казеина представляют собой крупные агрегаты макро­ молекул («истинный» молекулярный вес казеина равен 31 000 [267]).

На рис. 32 представлены результаты определения размеров час­ тиц методом дисперсии светорассеяния (при тех же условиях).

Рис. 31. Диаграмма Зимма для раствора казеина в боратном буфере (ионная сила р = 0,1; pH 8,5; 20° С)

с, = 0,038; сг = 0,051; с3 = 0,085 мг/мл

Рис. 32. Зависимость lg D от lg (1/А) для растворов казеина различной кон­

центрации (pH 8,5; 20° С)

1 — 1,74; 2 — 1,16; 3 — 0,87; 4 — 0,48; 5 — 0,29 в/100 мл

Ряд параллельных прямых относится к растворам разных кон­ центраций от с = 1,75 (кривая 1) до с — 0,29 г/100 мл раствора (кривая 5) и характеризуется одной и той же величиной п, а следо­ вательно, и неизменным в рассматриваемом диапазоне концентра­ ций размером частиц. Рассчитанная величина Rw равна 1760 А.

Способность казеина к сильной ассоциации широко известна. Образование крупных агрегатов (M w = 1,5- 10е) происходит либо в результате наличия кальция в исходном белке [267], либо в ре­ зультате гидрофобных взаимодействий неполярных аминокислот­ ных остатков молекул казеина [235], причем отмечается, что даже «следы» кальция могут вызвать агрегацию.

При pH > 10,5 агрегаты становятся неустойчивыми и распада­ ются. Аналогичное действие оказывает 8 М раствор мочевины.

111

Результаты определения размеров частиц двумя методами при­ ведены в табл. 8. Как видно из этой таблицы, оба метода дали близ­ кие величины радиусов частиц казеина. Под действием 0,1 N NaOH и 8 М раствора мочевины системы становились полидисперсными. Метод дисперсии светорассеяния дает величины, средние между этими крайними значениями.

Таким образом, большие частичные веса и размеры рассеива­ ющих центров казеина, а также их относительная устойчивость к действию 8 М раствора мочевины и сильной щелочи приводят к выводу, что существенную роль в их образовании играет кальций.

Для проверки этого предположения были исследованы раство­ ры казеина, очищенного от кальция. Полученные результаты при­ ведены также в табл. 8 и на рис. 33. На рисунке представлена об­ работка данных светорассеяния по методу Янга для растворов при pH 7,0 и 20° С. При этом оказалось, что М ю = 1,14-Ю5, {Bg)z = == 680 А и М п — 4,4-104, (Я g)n = 600 А. Размеры частиц в раство-

Рис. 33. Зависимость Kc/(R9sin2 0/2)

от (1 -(- 1000c)/sin2 0/2 для растворов очищенного казеина при pH 7,0;

р = 0,1; 20° С

о — малые углы; б — большие углы

Рис. 34. Зависимость удельной ин­ тенсивности светорассеяния водных растворов казеина от температуры

(рн 8,5; р = 0,1)

112

двойной экстраполяции. Несколько завышенный молекулярный

Специфический тип ассоциации в водных растворах монодисперсного освобожденного от ионов Са2+ казеина — агрегацию в результате гидрофобных взаимодействий неполярных аминокислот­ ных остатков молекул казеина удалось наблюдать в работе [260] по зависимости интенсивности светорассеяния от температуры (рис. 34). Наблюдающиеся зависимости были полностью обратимы.

Термодинамические параметры процесса агрегации были оце­ нены по зависимости константы равновесия от обратной темпера­

Величина и знак свободной энергии (—1,6 ккал1молъ), энталь­ пии (33 ккал!моль), а также большое положительное изменение энт­ ропии системы ~ 100 кал!моль-град подтверждают точку зрения, что повышение температуры приводит к укрупнению агрегатов за счет гидрофобных взаимодействий. Средневесовой частичный вес казеина при этом увеличился примерно в 2,5 раза (от 4,1-10® до

1-107).

Структурообразование в водных растворах казеина

При больших концентрациях и высоких значениях pH казеин образует прочные структуры. В работе Фиднея, Хиггинса и Эйса [268] исследовалось гелеобразование в щелочных растворах казеи­

113

на. При pH <( 11,5 получались системы высоковязкие, но не об­ ладающие жесткостью, гелеобразование вызывалось введением двухвалентных катионов. Проблеме вязкости казеиновых клеевых растворов и гелеобразования в таких системах посвящены работы Цоллера [269], Дьяченко [270], Наряномурти [256—259]. Известны работы, в которых изучалось влияние различных ионов на ско­ рость гелеобразования в концентрированных растворах казеина [271]. Для казеинов наблюдалось обратимое гелеобразование [272] при добавлении Са(ОН)2. Гелеобразование объяснялось образова­ нием Са-солевых мостиков между частицами казеина (pH 11,5— 12,5).

Большой интерес представляет работа Магиса [273], где при­ водятся диаграммы температура — концентрация гидроокиси ам­ мония для получения геля из 20%-ного раствора казеина. В другой работе этого автора рассматривается действие спиртов на гелеоб­ разование в казеине [274].

Вопрос о природе связей, стабилизирующих пространственные структуры в водных дисперсиях казеина, до сих нов не решен. Это связано ТГтем, что нет спёциальньпГ работ, посвященныхлсследо-_ ванию контактов, ответственных за г.труктурппбрязпияттй В ос­ новном исследователи пытались выяснить роль содержащих серу аминокислот в образовании пространственных структур. Так, Вормел [275], исследуя специфические группы, участвующие в гелеобразовании в системах казеин — вода — щелочь, пришел к вы­ воду, что стабилизующими гель группами являются группы цис­ теина. В работе Хиггинса, Фрэзера и Хейса [276], посвященной выяснению роли сульфгидрильных групп в образовании казеино­ вых гелей, изучался процесс выделения серы, освобождающейся под действием щелочи. Однако ввиду малого количества цистино­ вых остатков в казеине авторы приходят к заключению, что только S — S-связи не могут быть ответственны за структурообразование в концентрированных казеиновых системах. В работе [277] отме­ чалось, что если структурообразование инициировано ионами Са2+, основную роль в образовании структуры играют SH-группы ка­ зеина. Однако в работе [278] было показано, что в казеине не про­ исходит дисульфидный обмен и, следовательно, нет свободных SHгрупп.

Этим ограничиваются наши знания относительно связей, ста­ билизующих пространственные структуры казеина. Лишь в не­ скольких работах [256—259] отмечается влияние добавки диоксана на структурообразование в клеевых казеиновых растворах. Тот факт, что введение диоксана замедляет образование пространствен­ ной структуры (известно, что диоксан разрушает водородные свя­ зи), указывает на возможность стабилизации гелей водородными связями. В этой же серии работ показано, что введение Na2S03 в систему в количестве 4% не уменьшает склонности растворов ка­ зеина к структурообразованию, а, напротив, ускоряет этот процесс. Авторы перечисленных работ исследовали лишь условия получения

114

гелей и практически не изучали механизм гелеобцазования. В свя­ зи с этим одна из наших работ [253] была посвящена обсуждению механизма гелеобразования. В ней исследован процесс структурообразования в водных растворах казеина, а_также определен тип связей, обусловливающих прочность этой структуры, и прослежены конфирмационные изменения молекул (агрегатов) казеина, со­ провождающие процесс гелеобразования!

Для исследования структурообразования гелей казеина изу­ чалась кинетика роста прочности структуры (ее предельного на­ пряжения сдвига) и способность ее к обратимому восстановлению

Рис. 35. Изменение прочности пространственных структур в водных растворах казеина раз­ личной концентрации во вре­ мени (pH 12,9; 20° С)

1 — 14,0;

2 — 19,5;

3 — 19,8; i —20,5;

5 — 22,7 г/100 м л

после разрушения. Предельное напряжение сдвига определялось методом тангенциального смещения пластинки [197].

Процесс структурообразования идет во времени, и максималь­ ная прочность структуры достигается к 10—12 суткам; минималь­ ная концентрация белка, при которой происходит образование про­ странственных структур, должна быть выше 15 г/100 мл (рис. 35). Эта концентрация является важной величиной, определяющей ус­ ловия гелеобразования, и называется критической к онцентрацией, гелеобразования [297].

Существование критической концентрации при гелеобразовании белков связано с тем, что структурообразование осуществляется при достижении определенного соотношения между числом воз­ никающих внутримолекулярных и межмолекулярных связей с преимущественным образованием межмолекулярных связей [280].

При структурообразовании гелей казеина наблюдается индук­ ционный период, в течение которого прочность структуры не воз­ никает или она очень мала. Время индукционного периода умень­ шается с увеличением концентрации. Как показали данные по све­ торассеянию, оптическому вращению и дисперсии оптического вра­ щения, в индукционном периоде возникают агрегаты макромолекул казеина, которые являются элементами структуры геля. Зависи­ мость процесса структурообразования в водных суспензиях ка­ зеина от pH изучена нами в работе [253]. Для получения водных дисперсий казеина с известным значением pH растворы готовились по методике, описанной в работе [281].

115

Из рис. Зб и табл. 9 также видно, что при увеличении концент­ рации казеина в растворе повышается прочность пространственной структуры и уменьшается индукционный период. Подобные зако­ номерности характерны и для а- и (3-фракций казеина. Измерения удельного оптического вращения водных растворов казеина, как было показано выше, позволяют думать, что гелеобразование со­ провождается конформационными изменениями и агрегацией мак­ ромолекул белка, которая обусловлена гидрофобными взаимодей­ ствиями. .............. ......................... *'

Изрис. 36 видно, что максимальная прочность пространствен­ ной структуры наблюдается в интервале pH 12,9—13,3, что соот-

Рис. 36. Зависимость прочно­ сти гелей казеина (2) от pH среды при 20° С (с = 20,5 г/100 мл; измерено через 10 су­

ток) и удельного оптического вращения (1) (с = 1,12 г/100 мл;

измерено через 5 суток)

ветствует соотношению 8—10 г твердой щелочи на 100 г сухого ка­ зеина. Кривая 2 рис. 36 показывает конформационные изменения макромолекул казеина при изменении pH. Видно, что структурообразование наиболее эффективно протекает при определенных конформациях полипептидных цепей — при больших значениях удельного оптического вращения, свидетельствующих о разверты­ вании макромолекул казеина вследствие отталкивания одноименно заряженных участков молекул белка, наблюдается наибольшая прочность возникающих структур. В системе казеин — вода при

Таблица 9. Зависимость прочности и времени индукционного периода от концентрации казеина (pH 12,9; 20° С; измерено через 12 суток)

116

мости обратимы, что позволило вычислить константы равновесия при различных температурах, а затем графически определить энтальпию плавления геля. Эти величины для геля концентрации 18 г/100 мл оказались равными: 19 ккал/молъ при pH 12,9 (что соот­ ветствует разрушению двух—четырех водородных связей); 22 ккал/ /моль при pH 11,4 и 26 ккал/молъ при pH 10,7 (что соответствует разрушению трех — пяти водородных связей). Расчет термодинами­ ческих характеристик процесса плавления гелей (табл. 10) пока­ зал, что этот процесс сопровождается небольшими отрицательными изменениями свободной энергии AF (0,3—3 ккал/молъ) и большими положительными изменениями энтропии AS, как и при конформационных переходах в растворах казеина. Это дает основание счи­ тать, что по мере повышения температуры проявляются гидрофоб­ ные взаимодействия, которые, возможно, и препятствуют сниже­ нию прочности гелей до нуля.

Из данных по предельному напряжению сдвига геля казеина концентрации 18 г/100 мл при разных температурах нами опреде­ лялась энергия контактов в структуре гелей казеина по методу, предложенному Пурадье [121]. Данные представлены в табл. 11.

Вычисленная энтальпия образования одного моля связей для гелей при pH 12,9 незначительно увеличивается с повышением температуры, а для гелей при pH 10,7 и 11,4 температурная зави­ симость выражена ярче [282]. Порядок и величина значений энталь­ пии образования одного моля связей в гелях казеина свидетель­ ствует об участии водородных связей в структурообразовании (если принять, что энергия одной водородной связи равна 5 ккал! /моль). Малые величины АН, вычисленные по методу Пурадье, показывают, что в каждом контакте с увеличением температуры

118

все большее значение приобретают гидрофобные взаимодействия (эндотермические по природе), энергия которых порядка десятых долей килограммкалорий на моль, но число которых может быть велико.

Проведенные исследования предельного напряжения сдвига в водных структурах казеина совместно с данными удельного опти­ ческого вращения и его дисперсии показали важную роль водород­ ных связей в процессе образования трехмерных пространственных структур. Для подтверждения роли водородных связей в образо­ вании пространственных структур в водных растворах казеина*

Рк, Г1 м Z

Рис. 38. Изменение прочности пространственных структур ка­ зеина во времени (с = 20,5

г/100 мл\ pH 12,0; 20° С) при

введении различных добавок

1 — 0,27 моль Na-салицилата/ЮО г казеина;

2 — 0,01 моль HgCWlOO г казеина;

3 — 0,03 моль Na2S03/100 г казеина;

4— без добавок;

5— 8 М раствор мочевины

использовались также мочевина и салициловокислый натрий, ко­ торые разрушают водородные связи. Данные представлены на рис. 38. При добавлении мочевины до концентрации 8 молей к 20,5%- ному раствору казеина (кривая 5) структура образуется только через 30 суток и имеет низкую прочность. Сильное понижение прочности указывает на существенный вклад водородных и гидро­ фобных связей в образование пространственных структур казеина. То, что при добавлении салицилата натрия все-таки образуется структура, можно объяснить гидрофобным взаимодействием не­ полярных участков агрегатов казеина.

119