книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

Теоретически рассчитанное Немети и Шерагой число водород­ ных связей в воде при данной температуре довольно близко совпа­ ло с числом, установленным экспериментально по ИК-спектрам [36]. При 20° С средний кластер содержит около 57 молекул воды, около 10% всех молекул воды находится в кластерах, причем 30% молекул в кластерах имеют координационное число, равное четырем. Было также показано, что с повышением температуры заметно уменьшается средняя величина кластеров (от 90 молекул при 0° до 25 при 70° С). Хотя модель Немети и Шераги имеет не­ достатки (например, не может объяснить переходные изменения вязкости, показателя преломления, поверхностного натяжения и теплового расширения в области температур 30—40° С), она удов­ летворительно объясняет термодинамические свойства воды и вод­ ных растворов неполярных веществ.

Среди других моделей этого типа следует упомянуть модель, предложенную Эрландером [30], поскольку она объясняет такие разнообразные явления, как изменение растворимости углеводо­ родов с температурой, образование нерастворимых водных клатратов вокруг метана при высоких давлениях, способность инертных молекул повышать температуру замерзания воды и т. д.

Рассмотренные двухструктурные модели предполагают нали­ чие льдоподобных структур и области несвязанных плотноупакованных молекул воды. В плотной структуре преобладают динольдипольные и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, причем большая часть водородных связей порвана. Для плотной структуры энер­ гия, энтропия, плотность, подвижность, расстояние до ближайшего соседа и координационное число больше, чем для льдоподобной [35]. В моделях двух состояний одному состоянию соответствуют молекулы в узлах трехмерной сетки водородных связей, а друго­ му — молекулы, занимающие пустоты каркаса. Модели двух состояний обсуждены в работе [27]. Однако, как отметила Бирштейн [35], различие между моделями не столь существенное, как кажется на первый взгляд, и отражает различные термодинами­ ческие подходы к решению одной и той же проблемы.

Специфическая структура воды является причиной гидрофоб­ ных взаимодействий между неполярными молекулами или ради­ калами в водной среде (растворе). Термин «гидрофобные взаимо­ действия» был введен Кауцманном [33] для описания взаимного притяжения неполярных групп в водной среде. Хотя термин «гидрофобные взаимодействия» некоторые авторы считают не сов­ сем удачным [44, 45] и предлагают оперировать с изменениями термодинамических параметров соответствующих процессов, це­ лесообразно его сохранить для удобства и краткости описания.

Рассмотрим, какие изменения могут происходить в воде при внесении в нее молекул с углеводородными радикалами. Для такого рассмотрения лучше всего подходят углеводороды, так как в них отсутствуют полярные группы, сильно взаимодействующие как со свободными, так и со структурированными молекулами

10

воды. Водные растворы неполярных веществ, особенно углево­ дородов, обнаруживают аномалии термодинамического поведения. Растворимость углеводорода определяется изменением свободной энергии AF, которое складывается из энтальпийного и энтропий­ ного членов

с водой лишь слабыми ван-дер-ваальсовыми силами. Однако, не­ смотря на слабое взаимодействие (вернее именно благодаря ему), действие этих молекул на структуру воды весьма значительно [36].

Плохая растворимость углеводородов в воде связана не с уве­ личением энергии за счет замены более выгодных контактов вода— вода контактами углеводород — вода, как считали раньше, а с уменьшением энтропии. Как видно из табл. 1, растворение али­ фатических углеводородов в воде экзотермично (энергетически

Таблица 1. Изменение термодинамичесгих параметров при переносе углеводородов из неполярной среды в воду

выгодно), а ароматических — атермично. Несмотря на это, раст­ ворение углеводородов обоих классов сопровождается возраста­ нием свободной энергии из-за резких отрицательных изменений Д5.

Термодинамические параметры были найдены по формуле

а также по температурной зависимости К я х, где х — молярная концентрация; К — константа равновесия в системе углеводо­ род — водный раствор углеводорода (или его раствор в неполяр­ ном растворителе).

Растворение углеводородов в воде приводит к уменьшению эн­ тропии системы в результате увеличения доли упорядоченных элементов в структуре воды. Поэтому удаление молекул углево­ дорода из воды (переход их в неполярное окружение) сопровож­ дается увеличением энтропии и переходом системы в более выгод­ ное энергетическое состояние.

11

Энтропийная природа низкой растворимости углеводородов в воде была впервые установлена Батлером[46], который показал, что соответствующие эффекты связаны с изменениями в водной, а не в неполярной фазе. Многочисленные экспериментальные данные — изменение диэлектрических свойств растворов, расши­ рение линии ЯМР, снижение коэффициента самодиффузии—пока­ зывают, что неполярные молекулы стабилизуют структуру воды, т. е. упорядочивают ее, вследствие чего энтропия системы пони­ жается.

Наиболее подробно разработан механизм упорядочения струк­ туры воды в модели Немети и Шераги [16]. Согласно представле­ ниям этих авторов, растворение углеводорода в воде сопровож­ дается образованием частичного клатрата из молекул воды вокруг молекулы углеводорода (рис. 1). Так как при этом выпуклая поверхность почти сферического кластера становится вогнутой, то поверхностные молекулы воды могут образовывать макси­ мальное число водородных связей с соседями — четыре. Кроме того, образуется дополнительный — пятый ван-дер-ваальсов кон­ такт с молекулой углеводорода, т. е. молекула воды становится пентакоординированной. При этом понижается энергия молекул воды на величину А ( р и с . 2). Размещение молекул углеводорода в районах несвязанной воды может происходить только заменой контактов вода — вода контактами вода — углеводород. При этом сильные дипольные взаимодействия заменяются на более слабые индукционные и дисперсионные и энергия несвязанных

Рис. 1. Схематическое изображение структуры воды при внесении в нее углеводорода (по Немети и Шераге)

молекул воды возрастает на величину АЕ2. Молекулы с одной, двумя и тремя связями также присоединяют углеводород ценой потери контакта с несвязанной водой, а их энергия также возра­ стет на величину АЕ2. Изменение энергетических уровней влечет за собой изменение Их заселенности — число молекул на нижнем уровне, который в присутствии неполярной молекулы еще более понизился, возрастет, а на верхних уровнях понизится в соответ­ ствии с больцмановским фактором. Иначе говоря, возрастет сред­ нее число молекул, образующих упорядоченные структуры, или

12

среднее число существующих при данной температуре водородных связей.

Альтернативные представления о растворении неполярных молекул в воде представлены в работе [30]. Анализ эксперимен­ тальных данных, в частности, по растворению углеводородов в кон­ центрированных солевых растворах, а также температурной за­ висимости растворимости углеводородов приводит автора к выводу, что растворимость углеводородов в воде обусловлена несвязан­ ными молекулами воды, кластеры же оказывают на углеводороды

f 1 ПАР — “— - ---------

высаливающее действие. Однако независимо от того, каков в дей­ ствительности молекулярный механизм растворения углеводоро­ дов в воде, общий вывод, по-видимому, неоспорим: возможность образования упорядоченных структур в воде препятствует раство­ рению в ней неполярных молекул.

Гидрофобные взаимодействия являются частным случаем взаи­ модействий, обусловливающих нерастворимость данного вещества в данном растворителе. Эти взаимодействия определяются как ван-дер-ваальсовыми притяжениями самих неполярных групп, так и взаимодействиями этих групп с водой, которые, как было показано выше, связаны со структурой воды. Главное в теории гидрофобных взаимодействий, согласно Шераге [8],— это пред­ ставление о том, что число водородных связей, рассчитанное на моль воды, выше вблизи углеводородной молекулы. Гидрофобные взаимодействия приводят к большому отрицательному изменению свободной энергии (AF) в результате положительного изменения энтропии и малых изменений энтальпии. Энтальпийный член АН при гидрофобных взаимодействиях равен нулю для аромати­ ческих групп и положителен для алифатических. Движущей силой гидрофобных взаимодействий является изменение энтропии. Следствием термодинамики гидрофобных взаимодействий являет­ ся то, что с повышением температуры (до 60° С) эти взаимодейст­ вия увеличиваются. Максимум энергии гидрофобных взаимодейст­ вий для алифатических боковых цепей находится при 58° С, а для ароматических — около 42° С.

При растворении в воде веществ, содержащих полярные и не­ полярные группы, таких, как молекулы мыл, полимыл или белков, стремление неполярных групп выйти из водного окружения про-

13

Является в их взаимном притяжении, причем свободная энергия такого притяжения — гидрофобного взаимодействия — непосред­ ственно связана с рассмотренной выше величиной AF (см. табл. 1).

Термодинамические параметры гидрофобных связей, рассчи­ танные в работах [8—17] и представленные в табл. 2, обнаружива­ ют некоторое отличие от величин, приведенных в табл. 1, что мо­ жет быть связано с неполным устранением контакта углеводород­ ных молекул с водой при образовании гидрофобных связей в ре­ альных системах.

Таблица 2. Рассчитанные термодинамические параметры перехода

*При переходе в алифатический растворитель.

**При переходе в ароматический растворитель.

Гидрофобные взаимодействия в растворах веществ дифильного характера приводят к образованию компактных структур, обеспе­ чивающих наименьший контакт неполярных групп с водой. В случае растворов мыл такими компактными структурами явля­ ются мицеллы [47, 48]; в случае полимерных макромолекул, со­ держащих неполярные группы (в том числе биополимерных), это будут гидрофобные области, составленные из ассоциатов этих групп [49—51].

Чрезвычайно важной особенностью гидрофобных взаимодейст­ вий в водных растворах является тот факт, что эти взаимодейст­ вия, во-первых, выступают как фактор стабилизации нативных конформаций на различных уровнях организации биополимеров (вторичная, третичная и четвертичная структуры); а, во-вторых,

цепей в стабилизации нативной структуры белка была высказана Бреслером и Талмудом еще в 40-х годах [22]. Однако впоследствии главными силами, стабилизирующими структуру белка, считали водородные связи, и лишь в 1959 г. идея об определяющей роли гидрофобных взаимодействий вновь была возрождена Кауцман-

ном [33].

14

Немети и Шерага произвели также теоретический расчет термо­ динамических параметров образования гидрофобной связи между тремя неполярными аминокислотными радикалами, а также оце­ нили вклад гидрофобных взаимодействий в устойчивость глобулы в водной среде [10]. Хотя энергия гидрофобных взаимодействий невелика (0,2—1,5 ккал [10]), высокое содержание неполярных аминокислот в белке может дать большую суммарную величину, вносящую заметный вклад в стабильность глобулы белка.

В работах [8—18] на основе растворимостей углеводородов и статистико-термодинамической теории водных растворов были рассчитаны для таких взаимодействий величины AF и АН, AS и число молекул воды, дополнительно связанных водородными связями, а также число парных гидрофобных взаимодействий. Указанные величины приведены в табл. 3.

Кроме того, рассчитывались параметры гидрофобных взаимо­ действий между неполярными боковыми группами и аминокислот­ ными остатками, содержащими полярные группы, например глю­ таминовой кислотой, глютамином, лизином и тиразином. Было показано, что такие боковые группы могут взаимодействовать с другими боковыми цепями или даже с полипептидным скелетом, тогда как полярные группы контактируют с растворителем и дру­ гими полярными группами.

Таблица 3. Термодинамические и структурные параметры образования гидрофобных связей между двумя неполярными боковыми аминокислотами

Следует отметить роль дисперсионных сил в гидрофобных взаимодействиях. Дисперсионные силы повышают энергию взаимо­ действия между одинаковыми неполярными группами. Контакты между одинаковыми (алифатическими или ароматическими) груп­ пами приводят к уменьшению свободной энергии приблизительно на 0,5 ккал!молъ по сравнению с контактами между разными груп­ пами [8—18]. Это означает, что среди компактных структур бел­ ковой молекулы предпочтительными являются структуры, обеспе­ чивающие максимальное число контактов ароматических амино­

15

кислотных остатков с ароматическими (фенилаланин, триптофан, тирозин) и алифатических (лейцин, валин, аланин) с алифатиче­ скими.

Идеи Немети и Шераги о природе гидрофобных взаимодейст­ вий и их роли в стабилизации структур, образованных дифильными молекулами в водных растворах, успешно развиты в серии работ [52—54]. Развитие представлений о гидрофобных взаимодей­ ствиях привело к стремлению многих авторов количественно свя­ зать степень гидрофобности молекул белка со структурой и свой­ ствами белковых молекул. Так, Фишер ввел фактор полярности р (отношение объемов полярной и неполярной частей глобулы) и пытался найти соответствие между фактором р и общими чертами пространственного строения белка [55]. Работам Фишера пред­ шествовали исследования Во [56], который считал, что молекуляр­ ная структура белка может определяться соотношением полярных и неполярных остатков (им был введен параметр NPS — частота неполярных остатков). Другой подход к оценке степени гидро­ фобности белка и вклада гидрофобных взаимодействий в устойчи­ вость нативного состояния имеется в работах Тенфорда и сотр. [57—62] и Бигелова [63], которые исходят из энергетических оценок переноса аминокислот и других дифильных молекул из полярного окружения в неполярное.

Анализ, проведенный Тэнфордом [57] для большого числа белков, показал, что в большинстве случаев величина 2 А/, ответ­ ственная за гидрофобные взаимодействия, близка к величине ГАА (AS — изменение конформационной энтропии). Этот факт означает, что для большинства глобулярных белков возможность существовать в свернутом (нативном) состоянии обеспечивается почти целиком одними лишь гидрофобными взаимодействиями. Вопрос о роли гидрофобных взаимодействий в поддержании компактных белковых структур подробно освещен в обзорах

[51, 64, 65].

Внастоящее время некоторыми авторами высказывается идея

отом, что распределение полярных и неполярных аминокислот

вдоль полипептидной цепи является одним из важных элементов кодирования пространственной структуры глобулярных белков. Еще Фишером [55] было показано, что соотношение суммарных объемов полярных и неполярных аминокислотных остатков может обусловливать форму белковой молекулы (сферическую или вы­ тянутую), а также способность образовывать четвертичные струк­ туры. Анализ, проведенный Перутцем, Кендрью и Уотсоном [66] на примере восемнадцати аминокислотных последовательностей в раз­ личных миоглобинах и гемоглобинах, показал, что из 150 остатков, входящих в эти молекулы, 33 находятся в местах, экранирован­ ных от контакта с водой, т. е. во внутреннем ядре белковой глобу­ лы, причем 30 из 33 являются неполярными аминокислотами (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, пролин, цистеин, метионин, тирозоин и триптофан). Это наводит

16

на мысль о том, что для поддержания н э т и е н о и пространственной структуры глобулярных белков необходимо определенное распре­ деление неполярных аминокислот вдоль цепи (такое, чтобы они могли образовывать неполярное ядро глобулы) [65]-. Наличие неполярного ядра в большей или меньшей степени показано и для других белков, пространственная структура которых изучена рентгенографически, например в лизоциме [67] и а-химотрипсине [68]. Таким образом, образование неполярного ядра является очень существенным элементом укладывания белковой молекулы в специфическую пространственную структуру. Это подтверждает­ ся многочисленными данными [69, 70], показывающими, что введение в водные растворы белков веществ, улучшающих раство­ римость неполярных групп и тем самым препятствующих образо­ ванию гидрофобных контактов (алифатические спирты, мочевина, диоксан и др.), приводит к разрушению нативной компактной структуры белков.

Представления о механизме возникновения гидрофобных взаи­ модействий, развиваемые Шерагой, подтверждаются при наблю­ дении ряда свойств водных растворов глобулярных белков и ПАВ. Исследование указанных систем представляется чрезвычайно пло­ дотворным для получения экспериментальных доказательств ос­ новных предпосылок теории гидрофобного взаимодействия. Бе­ зусловно, необходимы и прямые исследования структурирования воды вблизи углеводородных молекул. Некоторые попытки таких исследований были выполнены Песиком и Клиффордом [71] с помощью ЯМР-спектроскопии, однако пока не получено ясных результатов. Тем не менее Герцем и Цайдлером [72] показано, что время релаксации молекул воды вблизи углеводородных мо­ лекул в 2 раза больше, чем у чистой воды. Создание количествен­ ной теории жидкой воды и, следовательно, детального механизма гидрофобных взаимодействий возможно только при комплексном рассмотрении данных, получаемых при исследованиях водных растворов как методом ЯМР, так и в результате разнообразных физико-химических исследований систем, свойства которых оп­ ределяются гидрофобными взаимодействиями.

Прекрасным примером проявления гидрофобных взаимодейст­ вий являются растворы мыл. Их молекулы состоят из относитель­ но длинной углеводородной цепи и полярной группы. Химическая природа полярных групп влияет на мицеллообразование в рас­ творах ПАВ, изменяя критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ), размер мицелл и их устойчивость в различных ус­ ловиях. Но взаимодействие неполярных групп является решающим в процессе мицеллообразования, на что указывалось уже в ран­ них теориях мицеллообразования, развитых Ребиндером [73] и Гартлеем [74].

Водные растворы глобулярных белков с физико-химической

на во многом сформированной мицелле ПАВ. Мицеллярный вес по порядку величины соответствует молекулярному весу глобу­ лярных белков (10 000—80 000). В областях малых концентраций (но выше ККМ) мицеллы ПАВ всегда достаточно симметричны, сохраняют сфероидальную форму, полярные группы обращены в сторону воды и гидратированы. Это означает, что такие мицеллы вполне стабилизированы. Их межфазное натяжение (удельная свободная поверхностная энергия на границе с окружающей дис­ персионной средой) очень близко к нулю. Они не могут поэтому взаимодействовать друг с другом с образованием анизометриче­ ских цепочек или пространственных структур, что обнаруживает­ ся реологическими методами. Подробное физико-химическое опи­ сание поведения мицеллярных растворов ПАВ можно найти в ра­ ботах Маркиной с сотр. [75—80]. Многие глобулярные белки в водных растворах также имеют форму, близкую к сферической.

Размер мицелл ПАВ совпадает по величине с размером глобу­ лярных белков в водном растворе. Большой вклад в стабилизацию пространственной компактной структуры глобулярных белков и мицелл ПАВ вносят гидрофобные взаимодействия, приводящие к образованию в глобулах белков и в мицеллах неполярных обла­ стей. Поланд и Шерага [81] рассмотрели стабильность.мицеллы, образованной неионогенными ПАВ, с точки зрения представлений о гидрофобных взаимодействиях. Авторам удалось объяснить за­ висимость размера мицелл от концентрации и температуры. Образование мицелл и глобул белка сопровождается весьма незна­ чительным выигрышем энтальпии, но значительным увеличением энтропии. Явления мицеллообразования связаны с вытеснением неполярных групп из воды в результате сильного взаимодействия ее полярных молекул и ван-дер-ваальсовым сцеплением углево­ дородных цепей, т. е. гидрофобные взаимодействия также играют существенную роль в стабилизации мицелл. Следовательно, природа мицеллообразования не только энергетическая, но и энтропийная. Подобный подход был успешно применен при рассмотрении мицеллообразования в случае ионогенных мо­ лекул [82—84] и полимерных мыл [85]. Термодинамика мицеллооб­ разования подробно обсуждена в работе Песика [86].

В настоящее время накоплено много фактов о роли взаимодейст­ вий неполярных боковых групп в стабилизации структуры глобу­ лярных белков. Относительное число аминокислот с неполярными боковыми цепями велико (30—50% от общего числа боковых ос­ татков), поэтому энергетический вклад гидрофобных взаимодейст­ вий в стабилизацию белковой структуры достигает значитель­ ной величины. Внутримолекулярные гидрофобные взаимодействия и их влияние на конформацию спиральных полиаминокислот рас­ смотрены в работе Шераги и Немети [10]. В а-спирали данная боковая цепь может взаимодействовать с аминокислотным ос­ татком в следующем витке, т. е. с третьим или четвертым остатком вдоль цепи, давая дополнительный вклад в стабилизацию а-спи-

18

рали [83]. Сильные гидрофобные взаимодействия возникают также и в складчатых структурах. Возникновение гидрофобных взаимо­ действий является причиной образования ^-структуры при повы­ шении температуры в полипептидах, содержащих много неполяр­ ных групп [8]. Немети и Шерага [9] показали, что гидрофобные взаимодействия влияют на температурный переход спираль — клубок. По их теоретическим расчетам, в результате гидрофобных взаимодействий боковых цепей температурный переход полйаланина, состоящего из 100 аминокислотных остатков, должен быть на 175° выше, чем у полиглицина такой же длины. Эксперименталь­ но же было найдено, что поли-А-аланин, состоящий из 175 остат­ ков, сохраняет а-спиральную конформацию вплоть до 95° С, а полиглнцин не существует в неводных растворителях в а-спираль- ной конформации.

Гидрофобные взаимодействия возникают в белке, находящемся в состоянии клубка. В том случае, когда большинство связей, стабилизующих вторичную структуру, разорвано, даже малое число гидрофобных взаимодействий играет решающую роль в ста­ билизации конформации. Нужно еще отметить, что наличие гид­ рофобных групп в белковой молекуле, вполне возможно, является не только фактором, стабилизирующим нативную пространствен­ ную структуру, но и имеет непосредственное значение для катали­ тического акта. Как подчеркнул Перутц [87], неполярная среда с низкой диэлектрической проницаемостью, возможно, усиливает электростатические взаимодействия субстрата с поляр­ ными группами фермента, увеличивая тем самым скорость хими­ ческих реакций. В работах Березина и Мартинека с сотр. [88] обнаружено, что гидрофобным взаимодействиям принадлежит главная роль при связывании конкурентных ингибиторов а-химо- трипсином.

Одним из важных следствий гидрофобных взаимодействий, приводящих к образованию гидрофобной области (ядра) или обла­ стей в структуре белка, является связывание белками малых мо­ лекул неполярного характера. Как будет показано в дальнейшем, гидрофобные области являются местами связывания различных не­ полярных молекул: углеводородов, красителей, жирных спиртов, кислот и других ПАВ.

СОЛЮБИЛИЗАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ ГЛОБУЛЯРНЫМИ БЕЛКАМИ

Природа сил, приводящих к существованию ПАВ в водных рас­ творах выше ККМ в мицеллярном виде и белков в глобулярной форме, как было показано в [57, 65, 89—91], одинакова. В резуль­ тате гидрофобных взаимодействий в ассоциированных в мицеллу ПАВ и глобулярных белках создаются неполярные области, су­ ществование которых обусловливает повышение растворимости углеводородов в водных растворах мицеллярных ПАВ и глобу­ лярных белков. Растворимость углеводородов в растворах ПАВ

19