книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

выше ККМ в Достаточно разбавленных растворах пропорцио­ нальна концентрации ПАВ. С точки зрения способности солюбили­ зировать углеводороды глобула белка аналогична сформирован­ ной мицелле ПАВ.

Методы исследования солюбилизации

Подробные сведения о методах исследования солюбилизации представлены в известной монографии Мак-Бена [2] и обзоре Клотца [92]. Взаимодействие белков с неполярными веществами (например, с красителями, углеводородами, ПАВ, липидами, жирными кислотами) определяют методом равновесного диализа, рефрактометрическими, спектрофотометрическими, электрофоре­ тическими и другими исследованиями. Почти все методы можно отнести к одной из двух категорий, основанных на изменениях ли­ бо свойств реагирующих с белками молекул, либо поведения мо­ лекул белка. К первой категории относятся: метод насыщения водных растворов из газовой фазы [2], равновесный диализ [93, 94], ультрафильтрация, ультрацентрифугирование, распределение между фазами [95], метод электродвижущих сил, перенос в элек­ трическом поле, диффузия, изменение спектра лиганда [96—98] и др. Ко второй группе относятся методы, основанные на изменениях оптических свойств белка, такие как спектрофотометрия, рефрак­ тометрия, светорассеяние, оптическое вращение [94, 99, 100]. Кроме того, известны методы, основанные на измерении pH, кри­ вых титрования, смещения изоэлектрической точки, осмотическо­ го давления, седиментации, электрофореза, вязкости, поверхност­ ного натяжения и др.

В последние годы для изучения взаимодействия белков с ли­ гандами используют метод ЯМР [101—103], основанный на изме­ нении ЯМР-спектров белка в присутствии, например, ПАВ, а также метод, основанный на изменении спектров флуоресцен­ ции (уменьшение интенсивности и смещение максимума испус­ кания) [104]. Большое преимущество этих методов связано с тем, что они позволяют не только произвести количественную оценку величины связывания, но также дают возможность проследить изменение конформации белка, вызываемое лигандом, и в сово­ купности с другими методами определить характер связывающего места. В работе [105] предложен метод определения растворимо­ сти углеводородов в растворах белков методом газо-жидкостной хроматографии.

Обработка результатов проводится обычно с помощью уравне­

20

Где г — число молей связанного лиганда па-Моль белка; п — мак­ симальное число независимых мест связывания; К — характери­ стическая константа связывания; [А] — концентрация свободного лиганда в растворе.

Эти уравнения являются следствием приложения закона дей­

Внаших работах для определения растворимости жидких углеводородов в растворах белков применяли методы равновес­ ного диализа, спектрофотометрический, рефрактометрический, ве­ совой.

Всвязи с тем, что при исследовании солюбилизации углеводо­ родов наиболее удобными оказались два последних метода, рас­ смотрим их несколько подробнее. Рефрактометрический метод оценки взаимодействия углеводородов с белками прост и удобен

вработе с ароматическими углеводородами, так как показатели преломления ароматических углеводородов сильно отличаются от показателей преломления водных растворов белков. Чувстви­ тельность рефрактометрического метода снижается при исполь­ зовании алифатических углеводородов. Однако многократное по­ вторение опытов по определению растворимости предельных угле­ водородов делает рефрактометрический метод вполне пригодным для количественной оценки связывания белками и алифатических углеводородов.

Существенная разница плотностей воды, водных растворов белков и алифатических углеводородов обеспечивает примени­ мость весового метода для оценки связывания алифатических углеводородов белками.

Рефрактометрический метод, предложенный и разработанный Юрженко [107], основан на том, что с введением углеводорода в раствор ПАВ показа­ тель преломления раствора обычно возрастает вплоть до насыщения его угле­ водородом и затем становится постоянным. В работах Воюцкого и сотр. [108, 109] было показано, что растворимость жидкостей может быть определена на основе правила аддитивности удельной рефракции. Для удельной рефракции системы, представляющей собой раствор солюбилизирующего агента с вве­ денным в него до насыщения углеводородом, можно написать следующее вы­ ражение:

21

Сятея соответственно к солюбилизирующему агенту, к конечному раствору, поглотившему углеводород, и к углеводороду.

Заменив весовые количества компонентов объемными и обозначив выра­ жение (п2 — 1)/(п2 -+- 2) через П с теми же индексами, получим

Пренебрегая отклонениями от аддитивности объемов, т. е. принимая, что объем раствора равен объему компонентов

получаем

(Fy + F a) n p = F an a + F yn y

И

где Fa = const, Fy — объем углеводорода, растворенного в растворе белка.

Весовой метод определения солюбилизации. Харкинс [110] предложил из­ мерять растворимость углеводородов весовым методом. Этот метод заключает­ ся в определении плотности растворов, поглотивших углеводород. При рас­ творении углеводорода в растворах солюбилизирующего агента плотность системы уменьшается вплоть до насыщения раствора углеводородом, а за­ тем остается постоянной. По точке перегиба на кривой, выражающей за­ висимость плотности от количества введенного в систему углеводорода, мож­ но определить растворимость углеводорода в данном солюбилизирующем агенте.

Плотности, измеренные при температурах, близких к 20° С, приводились к плотности при 20° С по формуле

где р = 0,000251 градг1-, t — температура.

Солюбилизация углеводородов изучалась в водных растворах глобулярных белков: яичного альбумина, сывороточного альбу­ мина, у-глобулина, лизоцима, а-казеина, пепсина, а-химотрипси- на, трипсина. Анализ аминокислотного состава белков позволил сделать заключение об определяющей роли гидрофобных взаимо­ действий в стабилизации их глобулярной структуры.

Проведение кинетических измерений показателя преломления контрольного раствора белка и водного раствора белка после до­ бавления к нему избытка углеводорода (рис. 3) позволяет вполне удовлетворительно определять показатель преломления насыщен­ ной углеводородом системы и по уравнениям (6) и (9) рассчитать растворимости углеводорода в растворе белка. Специальными исследованиями показано, что солюбилизация углеводородов в растворах белков обратима. Ниже приведены результаты измере­

ний показателя преломления (пд), удельной вязкости (ц) и удель­

ного оптического вращения (— [а]^) исходных растворов аль­ бумина (1) и после десолюбилизации (2); (бензол удалялся из системы при понижении упругости пара бензола над раствором):

22

В растворах изученных белков происходит увеличение рас­ творимости бензола, пропорциональное концентрации белка в рас­ творе (рис. 4, 5). Очевидно, что линейную зависимость величин рас­ творимости бензола от концентрации белков в растворе следует считать общим свойством глобулярных белков, характеризующим процесс внутриглобулярного связывания бензола. При всех изу­ ченных концентрациях белков (в случае сывороточного альбуми­ на концентрация достигала 9-10-4, в некоторых случаях величи­ на концентрации достигала 1 *10-3 молъ1л) с одним молем опреде-

1 — у-глобулин;

2 — лизоцим

23

ленного белка связывается постоянное число молей бензола. Это обусловлено тем, что конформация глобулярных белков практи­ чески не зависит от концентрации белка в растворе и мало отли­ чается от конформации макромолекул глобулярных белков в кри­ сталлическом состоянии [111—114]. Однако при одинаковых весовых концентрациях растворимость бензола оказывается различной в растворах разных глобулярных белков, что, безус­ ловно, свидетельствует о различном связывании бензола глобу­ лами белков.

Зависимость солюбилизации бензола в растворах белков от pH среды

При различных воздействиях на структуру белка в водных растворах отмечается изменение его солюбилизирующей способ­ ности. Причем наиболее ярко взаимосвязь структуры белка и солю­ билизации проявляется при изменении pH. Известно, что в ре­ зультате электростатического отталкивания одноименных заря­ дов белки изменяют свою конформацию в сильно кислой и в сильно щелочной областях pH. Для понимания механизма взаимодей­ ствия белков с углеводородами важно знать, как влияет измене­ ние конформации глобулы белка при изменении pH на их солю­ билизирующую способность.

Влияние pH среды на удельное оптическое вращение раство­ ров яичного альбумина приведено на рис. 6. Уменьшение величины удельного оптического вращения раствора яичного альбумина, со­ любилизировавшего бензол, свидетельствует о том, что глобулы становятся более симметричными. На кривых обнаруживаются две области с постоянными значениями оптического вращения — в области pH 4,7—6,7 и в области pH 8—10,5. В этих интервалах pH конформация молекул яичного альбумина, очевидно, не изме­ няется. Однако конформации глобул, отвечающие положению этих двух областей pH, неодинаковы, хотя в литературе до сих пор считалось, что глобулы яичного альбумина неизменны в интер­ вале pH 4,5—10,5 [115].

Интересно выяснить, с какими конформационными измене­ ниями связано появление второй площадки при pH 8—10,5. Для этого была исследована обратимость изменений оптического вра­ щения при pH 9 и 12 [116]. Растворы подкислялись до одного и того же значения pH (6, 5). Как показали результаты этих опытов, изменения оптического вращения обратимы для растворов яичного альбумина при переходе pH от 9 к 6,5. При изменении же pH от 12 до 6,5 не наблюдалось полного обращения удельного оптическо­ го вращения. Обратимость изменения удельного оптического вращения растворов яичного альбумина при pH < 9, а также малая величина этого изменения свидетельствуют о том, что появ­ ление первой области с постоянным значением удельного враще­ ния вызвано не изменением степени спиральности, а скорее дефор­

24

мационными изменениями третичной структуры молекул белка. Появление второй площадки можно рассматривать как предденатурационные изменения, предшествующие необратимому нару­ шению нативной .^конформации макромолекул при pH _> 11.

Сравнение кривых 1 и 2 на рис. 6 показывает, что резкие подъмы на кривых (увеличение отрицательного удельного вращения) у растворов чистого яичного альбумина наблюдаются при более низких pH среды (в щелочной области) и при более высоких pH среды (в кислой области), чем у растворов яичного альбумина,

Рис. 6. Зависимость удельного оптического вращения растворов яичного альбумина до (1)

и после (2) солюбилизации бензола от pH среды при разных концентрациях белка

а — 0,7; б — 1,27; в — 2,1 г/100 мл

Рис. 7. Зависимость солюбилизации бензола (1), вязкости (2) и удельного оптического вращения (3) растворов у-глобулина от pH (с = 1,0 г/100 мл, t = 20° С)

S, г/100мл

солюбилизировавших бензол, причем эффект ярче выражен в раз­ бавленном растворе. Эти результаты свидетельствуют о повыше­ нии устойчивости глобул альбумина к кислотно-щелочной дена­ турации после солюбилизации бензола.

Исследование солюбилизации бензола в растворах яичного альбумина, пепсина и химотрипсина при разных значениях pH среды показало, что глобулярные белки обладают наибольшей солюбилизирующей способностью по отношению к бензолу вблизи изоэлектрической точки. Эта особенность, очевидно, является общим свойством глобулярных белков. Процесс денатурации, про­ исходящий с глобулярными белками в растворах при pH, далеких от изоточки, приводит к уменьшению растворимости бензола в рас­ творах белков.

В качестве примера на рис. 7 представлено изменение солюби­ лизации бензола у-глобулином от pH раствора. Данные по удель­ ному оптическому вращению и вязкости взяты из работы Янга и

25

Фостера [117]. Область pH 4—9, соответствующая нативному состояпикАбелка у-глобулина (минимальные значения вязкости и оптической активности), характеризуется постоянной связываю­ щей способностью белка по отношению к бензолу. Увеличения вязкости и оптического вращения при pH > 9 и < 4 свидетельст­ вуют о глубоких конформационных изменениях в структуре белка. Эти изменения вызывают уменьшение связывания бензола в интер­ валах pH 9—10 и 4—2. Однако области при pH < 2 и pH ]> 11 характеризуются возрастанием величины связывания |бензола. В нативном состоянии связывание углеводорода определяется числом и размерами гидрофобных областей. При отклонении в бо­ лее щелочные и кислые области осуществляется переход из натив­ ного состояния вследствие отталкивания одноименных зарядов в состояние «расширенное», характеризующееся раскрытием гид­ рофобных складок (подобно Е-форме сывороточного альбумина). Авторы [118] предполагают, что уменьшение связывания углеводо­ родов сывороточным альбумином в результате перехода N —»■F вызывается частичным разделением четырех субъединиц и разру­ шением гидрофобных областей, которые расположены в интерфа­ зах этих субъединиц.

При изучении эффекта Керра [119], а также при исследовании спектров флуоресценции у-глобулина [120] показано, что 90% ароматических остатков спрятаны внутри глобулы и находятся в гидрофобном окружении. При подробном изучении дифференци­ альных УФ-спектров у-глобулина Окуловым и Троицким [121] обнаружено, что примерно 17 остатков тирозина (из 56) и 3 остатка триптофана (из 22) расположены на поверхности нативной глобу­ лы; 7—8 тирозинов расположены в щелях глобулы и больше поло­ вины тирозинов (31—32) и подавляющая часть триптофанов нахо­ дятся внутри глобулы. Авторами было замечено, что при pH ~ 3 молекула у-глобулина может «набухать», что приводит к повыше­ нию доступности хромофоров без разрушения упорядоченных структур молекулы. Это, вероятно, связано с частичным разруше­ нием глобулярной (третичной) структуры без нарушения вторич­ ной. Если при этом частично или полностью разрушаются гид­ рофобные области, то естественно, что связывание углеводорода должно уменьшаться. Вероятно, такое поведение (существование частично развернутой формы белка) при изменении pH присуще всем глобулярным белкам. Однако для обнаружения этих форм недостаточно изучения только вязкости и оптической активности. Очень важную информацию может дать исследование связывания углеводородов. Дальнейшее увеличение заряда с изменением pH среды приводит белковую молекулу к состоянию, соответствующе­ му полной дезорганизации глобулы, разрушению ее третичной и вторичной структуры, т. е. к состоянию клубка.

Однако, как показано в работе [122], в макромолекуле в со­ стоянии клубка могут осуществляться взаимодействия, приводя­ щие к образованию гидрофобных областей. Доказательством этого

26

могут служить факты, установленные в работах [123, 124], показы­ вающие, что растворы полиметакриловой кислоты (ПМАК) в кис­ лой области pH и растворы желатины при температурах выше 35° С солюбилизируют бензол. Наличием гидрофобных областей в ПМАК объясняется более эффективная солюбилизирующая спо­ собность водных растворов ПМАК по сравнению с другими вини­ ловыми полимерами (рис. 8).

В работе Шикамы [93] показано, что ПМАК связывает углево­ дороды предельного ряда С2 — Св, а также некоторые многоядер­ ные ароматические углеводороды [125]. Возможность возникнове-

У, t/Шнл

Рис. 8. Зависимость растворимости бензола от концентрации водных растворов полиметакриловой кисло­ ты (1), полиакриловой кислоты (2), поливинилового спирта (3) и поливинилпирролидона (4) при 20° С

ния структурированных неполярных областей, стабилизирован­ ных гидрофобными связями в клубках, теоретически предсказана Шерагой и Немети [8—18]. Таким образом, возрастание связыва­ ния углеводорода в крайних областях pH можно, по-видимому, объяснить образованием новых гидрофобных областей в молекуле Т-глобулина, которая в этих условиях находится в состоянии клубка. Это подтверждается данными, полученными в работе Янга и Фостера [117]. Уменьшение удельного оптического вра­ щения и характеристической вязкости при pH < 2 свидетельству­ ют об образовании новых более компактных структур у-глобулина.

Исследование связывания углеводородов белками в широком интервале pH позволяет наиболее полно проследить связь между структурой белка и его солюбилизирующей способностью [126,127]. Поскольку эта связь выражается очень четко, а также вследствие того, что углеводороды, являясь чрезвычайно мягкими агентами, сами по себе не вызывают заметных изменений в структуре белка, исследование взаимодействия углеводород — белок наряду с дру­ гими физико-химическими методами (измерениями вязкости, оп­ тической плотности и др.) может служить методом оценки конформационного состояния белковой молекулы.

Результаты исследования зависимости связывания углево­ дорода от pH приводят к очень важному выводу: связывать может не только нативная, компактная структура, но и денатурирован­ ная, более рыхлая. Однако следует отметить, что для связывания необходимы не отдельные неполярные аминокислотные остатки, а ассоциаты из этих остатков, т. е, гидрофобные области.

27-

ВЛИЯНИЕ СОЛЮБИЛИЗАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ НА КОНФОРМАЦИЮ И ДЕНАТУРАЦИЮ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

Влияние лигандов, в том числе органических веществ, на струк­ туру и свойства белков очень разнообразно. Известно, что низшие спирты, амины, амиды и другие вещества вызывают развертывание белковых глобул [128, 130], понижают температуру термического перехода глобула — клубок 1131, 1321 (в случае рибонуклеазы) и перехода тройная спираль — клубок (для коллагена) [133]. Су­ ществуют многочисленные наблюдения, показывающие, что об­

УФ-спектров, оптического вращения [138—146]. Полная дезорга­ низация белка (денатурация) наблюдается при взаимодействии с большими количествами додецил- и тетрадецилсульфатанатрия [142—145]. С другой стороны, известно и стабилизирующее дей­ ствие органических соединений на структуру белка. Например, в работах [146—149] установлено, что низкие концентрации ПАВ стабилизуют белки против денатурации мочевиной в кислых и щелочных областях pH. Авторы [150] наблюдали стабилизирующее действие стероидов. В работе [151] также отмечалось стабилизиру­ ющее действие малых концентраций-ПАВ на структуру белка и разрушающее больших.

Низкие концентрации ПАВ увеличивали степень спиральности топо- и парамионизина, повышали температуру тепловой денату­ рации на 10—15°, способствовали повышению устойчивости бел­ ков к перевариванию трипсином [152]. Подобные результаты получены в работе Витвицкого [153]. Повышение термостабиль­ ности комплексов миоглобина с ПАВ обнаружено в работе [154], причем эффект сильнее выражен для Cie, С14 и С1о, чем для С8 и С6. Увеличение конформационной стабильности трипсина при взаи­

буфере (pH 7,8), содержащем жирную кислоту, наблюдали при одних значениях концентрации денатурирующее действие жирных кислот, а при других — защитное действие.

Все это многообразие влияния органических веществ на белко­ вые молекулы определяется, в основном, тремя факторами: кон­ центрацией органических молекул, длиной цепи их неполярной ласти и природой гидрофильной группы, причем осуществляться это действие может как путем непосредственного связывания (взаимодействия) дифильных молекул с молекулами белка, так и в результате изменения свойств воды как растворителя в присутст­ вии органических молекул. При низких концентрациях органиче­ ского вещества, когда его влияние на структуру воды невелико, преобладает эффект связывания. Связывание в таких условиях не вызывает конформационных изменений, белковых молекул (либо

-28

очень небольшое изменение) ([142—145] и даже способствует ук­ реплению белковой структуры. При больших концентрациях би­ полярного вещества изменяются свойства растворителя, причем чем длиннее углеводородная цепь дифильной молекулы, тем мень­ ше концентрация, при которой проявляется изменение свойств растворителя [128, 157]. Изменение свойств растворителя (от по­ лярного к неполярному) может привести к ослаблению гидрофоб­ ных взаимодействий, поддерживающих компактную глобулярную структуру, которое в конечном итоге приведет к полному развер­ тыванию глобулы. Тот факт, что связывание большого числа мо­ лекул углеводорода (например, 80 молекул бензола) не вызывает денатурации белка [122,126—129,158—160] свидетельствует о том, что развертывание глобул при больших степенях связывания ПАВ осуществляется не только из-за больших степеней связывания, но и вследствие больших концентраций ПАВ в растворе, приводя­ щих к существенным изменениям структуры воды.

Исследования влияния углеводородов на конформационное со­ стояние макромолекул глобулярных белков проводились методами оптического вращения и его дисперсии, вискозиметрически, спек­ трофотометрически и по изучению кинетических параметров фер­ ментативной активности, Вращение плоскости поляризации чрез­ вычайно чувствительно к изменению конформации белковых мо­ лекул. Правда, между оптической активностью и структурой белка нет простой и ясной зависимости, но значение оптической актив­ ности как характеристики степени конформационного изменения белков общеизвестно и играет большую роль при изучении процес­ сов денатурации.

Экспериментальные данные обрабатывали по уравнению Моффита — Янга для сложной дисперсии

М 0 — средний эквивалентный вес аминокислотного остатка; п — показатель преломления среды; X — длина волны; Х0 — длина волны, совпадающая с

длиной волны поглощения белка в УФ-области; [а] — величина удельного оптического вращения; а0 — постоянная, характеризующая взаимодействие

между молекулами растворителя и макромолекулами белка, которая учи­ тывает содержание спиральных форм в структуре и зависит от природы боко­ вых цепей аминокислотных веществ; Ь0 — постоянная, характеризующая

конформацию полипептидной цепи и количество спиральных участков в ней.

Бензол практически не влияет на конформацию глобулярных белков в растворе (табл. 4) — величина Ь0 практически не изме­ няется.

29