книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

процесса нарастания прочности и увеличение предельного зна­ чения прочности (рис. 25, г, д, е, 26, 27).

На рис. 25, г, д, е, представлено нарастание прочности адсорб­ ционного слоя водных растворов яичного альбумина в изоэлектрическом состоянии на границе с бензолом при 22, 40 и 55° С. Видно, что время достижения предельного значения прочности адсорбционного слоя зависит от концентрации: при 0,005 г/100 мл

Рис. 26. Изменение прочности межфазных адсорбционных слоев годных растворов а-казеина во времени на границе с воздухом

(1) и бензолом (2—6) (pH 10,8;

20° С) при различных концентра­ циях белка

Рис. 27. Изменение прочности межфазных адсорбционных слоев во времени на границе водный раствор ЧСА/бензол при разных концентрациях белка (pH 5,1; 19° С)

1 — 0, 1;

2 — 0,05;

3 — 0,008 г/100 мл

Рис. 28. Изменение прочности межфазных адсорбционных слоев на границе водный раствор яич­ ного альбумина/углеводород при pH 4,9 и концентрации белка

0,1 г/100 мл

1 — к-гептан, 22° С;

2— циклогексан, 22° С;

3— к-гептан, 55° С;

4— циклогексан, 55* С

200

оно составляет 150 мин, а при с = 1 г/100 мл — 45 мин (t — ~ 22° С). Величина предельной прочности также зависит от кон­

(рис. 25, б) предельное значение межфазной прочности увеличи­ вается примерно в 2 раза.

Наибольший интерес представляют результаты, полученные при 55° С (при температуре, близкой к температуре денатурации яичного альбумина в объеме раствора). Наряду с ускорением процесса образования межфазного слоя и резким увеличением прочности (при 55° С прочность слоя в 10 раз выше прочности слоев, образующихся при 22° С) наблюдаются заметные максиму­ мы на кривых. Максимумы прочности не наблюдаются для очень разбавленных растворов. Быстрое нарастание прочности, а затем спад во времени ярче проявляются при увеличении концентра­ ции яичного альбумина до 0,5 и 1 г/100 мл. Это явление далее будет рассмотрено подробнее. Здесь только следует указать на одно сопутствующее явление. При температуре 55° С наблюдают­ ся заметные складки и морщины в адсорбционном слое на границе раздела фаз; слой можно было удалить с помощью стеклянной палочки. Обращает на себя также внимание тот факт, что проч­ ность адсорбционного слоя а-казеина на границе с воздухом очень мала (10~3 дин/см), т. е. на 2—3 порядка меньше, чем на границе с бензолом.

Для выяснения влияния второй фазы на механические свой­ ства адсорбционных слоев глобулярных белков были выбраны наряду с бензолом н-гептан и циклогексан. На рис. 28 показано нарастание прочности адсорбционных слоев на границе раздела водный раствор яичного альбумина/гептан и водный раствор яичного альбумина/циклогексан при 20 и 55° С.

В табл. 9 и 10 представлены результаты исследований поверх­

Таблица 9. Солюбилизация (N) углеводородов в водном растворе сывороточного альбумина человека (с = 0 ,05 г /1 0 0 мл) и предельная прочность адсорбционного слоя на границе раствор Ч С А /углеводород

при pH 5,1 и 20° С

Вторая фаза N, м о л ь /м о л ь P g, д и н /с м Вторая фаза N , м о л ь /м о л ь Р8, д и н /с м

201

Таблица 10. Солюбилизация (У ) углеводородов в водном растворе а-казеина (с = 1,5 г/100 м л ) и предельная прочность адсорбционного слоя

на границе раствор а-казеина/углеводород при pH 10,6 и 20° С

Вторая фаза iV, моль/моль P g, дин/см Вторая фаза N , моль/моль Р , дин/см

также данные по связыванию углеводородов яичным альбумином и казеином в водных растворах (солюбилизация углеводородов).

Механизм образования межфазных адсорбционных слоев глобулярных белков обсуждался и ранее в ряде работ. Так, Александер и Чогел [127] считают, что в процессе адсорбции, протекающей на границе раздела фаз, вначале образуется моно­ слой из белка с гидрофобными участками молекул, обращенными к маслу, и гидрофильными,— к воде. Следующие молекулы, которые подходят к поверхности раздела благодаря давлению адсорбционного слоя, имеют тенденцию вытеснять с поверхности менее поверхностно-активные сегменты молекул, связанные в монослое силами когезии, вследствие чего сегменты молекул адсорбционного слоя образуют свободные петли или складки. Это приводит к тому, что увеличивается число полярных областей молекул белка на границе раздела фаз. Поверхность слоя, обра­ щенного к воде, становится более гидрофильной, что должно приводить к образованию толстых структурированных слоев.

Изучалось влияние природы второй фазы на поверхностное натяжение некоторых белковых систем (яичного альбумина, пеп­ сина, гемоглобина) [128]. В качестве масляной фазы были взяты бромбензол, холестерин в бензоле, пальмитиновая кислота, олеи­ новая кислота и лецитин. Автор пришел к выводу, что между молекулами масла и белком не образуется комплексов. По нашему мнению, эти выводы не вполне убедительны и требуют пересмотра.

По Александеру [129], должно наблюдаться понижение проч­ ности адсорбционного слоя белка при замене воздуха на масло, что может происходить по двум основным причинам. Во-первых, вследствие меньшего значения межфазного натяжения на границе с маслом наблюдается меньшая тенденция адсорбции молекул белка и межфазные слои будут становиться тоньше; во-вторых, наличие масла понижает ван-дер-ваальсовы силы притяжения между гидрофобными боковыми группами, которые, по мнению автора, должны внести заметный вклад в общую прочность.

202

Таблица 11. Поверхностные свойства белков на границах раздела фаз

с воздухом и углеводородами не укладываются в схему, данную Александером. По нашему мнению, увеличение прочности на границе с углеводородом связано с тем, что углеводород на границе раздела фаз способствует процессу более глубокого развертывания белковой глобулы вследствие проникновения в неполярные области молекул белка, что увеличивает гибкость и подвижность сегментов макромолекул. С этим также согласуют­ ся и данные Дэвиса [130, 131].

В табл. 11 приведены сведения, характеризующие свойства молекул белка на границе с воздухом и маслом [131]. Из данных табл. 9 видно, что на границе с маслом энтропия денатурации на порядок больше, чем на границе с воздухом. Это связано с боль­ шей гибкостью молекул белка, которая также на порядок выше на границе с маслом. Однако белки на границе с маслом сохра­ няют некоторые поперечные связи, снижающие гибкость белков на порядок по сравнению с гибкостью полимерного клубка в тех же условиях.

Эти данные являются дополнительным доказательством раз­ личного конформационного состояния молекул белка на разных границах раздела фаз. Прочность на границе раздела водный раствор белка/углеводород характеризуется, во-первых, более высокими предельными значениями прочностей межфазных слоев, и во-вторых, зависит от размера углеводородных молекул, состав­ ляющих масляную фазу. Прочность адсорбционных слоев водных растворов сывороточного альбумина и а-казеина на границе с различными углеводородами (см. табл. 7,8) неодинакова. На границе с теми углеводородами, которые хорошо солюбилизи­ руются, т. е. проникают внутрь глобул белков по гидрофобным участкам в объеме водного раствора, прочность адсорбционных слоев больше. Следовательно, солюбилизация углеводородов мак­ ромолекулами белков, приводящая в объеме раствора к образо-

203

ванию более компактных глобул, на границе раздела фаз способ­ ствует увеличению степени развернутости макромолекул белков и, следовательно, возникновению большей прочности на границе с этими же углеводородами.

Итак, более глубокая денатурация белка на границе с маслом приводит к возрастанию прочности межфазных слоев. Подтвердить это положение можно опытами, в которых измеряется поверхност­ ная прочность слоев при заведомо протекающих процессах поверх­ ностной денатурации белков (при повышении температуры и добавлении денатурирующих агентов). Повышение температуры приводит к разрушению нативной структуры глобул — молекулы денатурируются и развертываются, вследствие чего изменяется гидрофильно-гидрофобный баланс молекул. При этом наблюдает­ ся ускорение процесса образования прочного межфазного слоя

[27, 28].

Интересные данные наблюдаются при исследовании прочно­ сти межфазного адсорбционного слоя яичного альбумина при 55° С. В течение некоторого времени наблюдается нарастание прочности межфазного адсорбционного слоя, а затем прочность падает. По нашему мнению, это связано с тем, что вследствие денатурации молекул яичного альбумина в объеме увеличивает­ ся скорость нарастания межфазной прочности. Со временем (осо­ бенно при больших концентрациях яичного альбумина) адсорб­ ционные слои все больше и больше сжимаются, образуются склад­ ки, а при еще большем сжатии возникают длинные тонкие нити агрегатов молекул. Возникновение этих нитей совпадает с умень­ шением межфазной адсорбционной прочности. Образование фиб­ рилл наблюдалось и другими авторами [132]. Этот процесс анало­ гичен процессу, который происходит при сжатии монослоев, приводящему к разрушению. Действительно, Булл [133] наблю­ дал под микроскопом появление складок и морщин при сжатии монослоев яичного альбумина до 18 дин!см при комнатной темпе­ ратуре. Интересно отметить, что при изменении температуры эти складки и нити не исчезали, что свидетельствует о том, что образующийся адсорбционный слой необратим.

При малых концентрациях яичного альбумина прочность меж­ фазного слоя на границе с бензолом не обнаруживала максимума во времени, так как в этом случае поверхностное давление, при­

0,05 з/100 мл. Здесь уместно упомянуть о работе Булла по иссле­ дованию адсорбции яичного альбущина на стекле [134]. Автор нашел, что адсорбция имеет предельное значение, характерное для каждой концентрации, и что адсорбция необратима. Адсорб­ ционный слой на границе со стеклом находится в более конденси­ рованном состоянии, чем на границе с воздухом. Предельные значения поверхностной прочности межфазных адсорбционных слоев глобулярных белков (яичного и сывороточного альбу­

204

минов) возрастаю? с увеличением температуры формирований слоя (рис. 29 и 30). Особенно сильно сказывается влияние темпе­ ратуры на величине предельной прочности в тех случаях, когда в качестве неполярной фазы служат углеводороды (рис. 33, кри­

вые 1 и 2).

Измерения прочности на границе водный раствор а-ка- зеина/бензол при различных температурах (рис. 31, кривая 2) показали более сложную зависимость прочности от температу­ ры. Сначала прочность межфазного слоя резко возрастает с

Р5,дин/см

Рис. 29. Зависимость прочности межфазных адсорбционных слоев ЧСА (с = 1 г/100 мл) на границе

с бензолом от температуры при pH 5,1

Зин/С»

Рис. 30. Зависимость прочности межфазных адсорбционных слоев яичного альбумина (с=1 г/100 мл)

от температуры на границе с воздухом (2) и бензолом (2)

Рис. 31. Зависимость удельного оптического вращения (1) водных

растворов а-казеина, прочности межфазных адсорбционных слоев

(2) и времени жизни капель бен­ зола (3) на границе водный рас­ твор а-казеина (с= 2,0 г/100 мл)/

/бензол от температуры (pH 10,6)

205

ростом температуры (от 0,3 при 20° С до 1,5 дин/см при 32° С), а затем уменьшается (до 0,90 дин/см при 20—50° С). Такая зави­ симость межфазной прочности от температуры является след­ ствием изменения конформационного состояния макромолекул а- казеина. Из рис. 31 (кривая /) видно, что удельное оптическое вращение казеина с увеличением температуры уменьшается от —105° (при 10° С) до —65° (при 50° С). Если принять во внима­ ние, что а-казеин содержит пролин, и допустить некоторую долю спирального скручивания [135—139], то уменьшение удельного оптического вращения можно связать с переходом от структуры, содержащей упорядоченные спиральные области в состояние ста­ тистического клубка.

С другой стороны, пролиновые остатки в а-казеине не способ­ ствуют образованию а-спиральной конформации и проявляются в межмолекулярных реакциях, например в ассоциации (агрега­ ции) при повышении температуры. Приведенные данные позво­ ляют объяснить повышение прочности адсорбционного слоя а-ка- зеина при повышении температуры переходом от более упорядо­ ченной конформации к менее упорядоченной — состоянию ста­ тистического клубка, при выходе которого на границу фаз воз­ никает дополнительное число межмолекулярных связей, как водо­ родных, так и гидрофобных. Уменьшение прочности при темпе­ ратурах выше 30° С, вероятно, связано с появлением в растворе агрегатов. Образование агрегатов а-казеина при повышенных температурах, так же как и образование таких агрегатов при больших концентрациях, приводит к уменьшению прочности меж­ фазных слоев. Время жизни капель бензола на границе водный раствор а-казеина/бензол при тех же условиях изменяется в полном соответствии с прочностью адсорбционных межфазных слоев (см. рис. 31, кривая 3).

Проведенные исследования показывают, что наиболее проч­ ные межфазные слои возникают в условиях, обеспечивающих образование на поверхности максимального числа межмолеку­ лярных связей, что осуществляется при максимальной разупорядоченности макромолекул, попадающих на границу раздела фаз.

Рассмотрим теперь, какие межмолекулярные связи участвуют в образовании необратимого прочного межфазного адсорбцион­ ного слоя. Можно ожидать, что в образовании межмолекуляр­ ных связей будут участвовать те же типы связей, которые обеспе­ чивают определенную конформацию молекул белка в растворе. Все эти типы связей электрической природы, но различной силы: кулоновское взаимодействие, ван-дер-ваальсово взаимодействие и водородные связи. При денатурации молекул яичного альбу­ мина разрываются внутримолекулярные водородные связи и ван- дер-ваальсовы («гидрофобные») связи, при этом образуются в соответствующих условиях межмолекулярные связи.

Еще Лэнгмюр [52], исследуя механические свойства белко­ вых монослоев, пришел к выводу, что прочность монослоев являет­

206

ся мерой числа и силы поперечных связей между полипептидными цепями. Различие в механических свойствах монослоев белков, по мнению Лэнгмюра, указывает на то, что поперечные связи между боковыми цепями являются важным условием образова­ ния твердых поверхностных слоев. Следует заметить, что термин «поперечные связи», применявшийся Лэнгмюром для глобуляр­ ных белков, соответствует по существу современному названию «гидрофобные связи».

На роль водородных связей в пограничных слоях не обраща­

без добавок

ISO П мим

141], изучая влияние водородных связей на вязкость и упругость монослоев белков и их моделей, нашел, что в системах, где обра­ зуются водородные связи, добавление агентов, разрушающих последние, вызывало уменьшение вязкости и упругости.

В нашей работе было обнаружено, что добавление 10% салицилата натрия не вызывало понижения межфазной прочности яичного альбумина (рис. 32), как ожидалось бы в случае большого участия водородных связей в образовании двухмерных структур его адсорбционного слоя. В действительности добавление салицилата натрия приводило к небольшому ускорению образо­

разрушает водородные связи в глобулах яичного альбумина, глобулы разворачиваются, изменяется гидрофильно-гидрофобный баланс, который увеличивает адсорбцию.

Вывод о том, что самым важным типом связи, обусловливаю­ щим прочность межфазных адсорбционных слоев водных раство­ ров глобулярных белков на границе как с воздухом, так и с маслом, являются гидрофобные взаимодействия между отдельными гидро­ фобными участками цепей молекул глобулярных белков, под­ тверждается опытами по изучению прочности межфазных адсорб­ ционных слоев а-казеина с разрушенными S—S-связями. В ка­ честве агента, разрушающего S—S-связи, был выбран сульфит натрия. Из табл. 12 видно, что прочность адсорбционных слоев

207

на границе водный раствор а-казеина/углеводород в присутствии сульфита натрия больше, так как разрыв S—S-связей в макро­ молекулах приводит к большему их развертыванию и образованию дополнительных межмолекулярных контактов.

Таблица 12. Влияние разрушения S—S-связей на прочность межфазного адсорбционного слоя се-казеина на границе водный раствор а-казеина/углеводород при pH 10,8 и 20° С

Белки очень чувствительны к изменению активности водород­ ных ионов в связи с множеством способных к ионизации групп в молекуле. Для выяснения роли заряда молекул глобулярных белков на скорость образования адсорбционного слоя и величину прочности, а также на время жизни элементарных капель нами изучалось поведение межфазных слоев глобулярных белков при разных pH среды от 2 до 10 и 22 и 55° С.

Исследователей, изучавших поверхностные свойства белков, всегда интересовало поведение молекул белка при различных pH среды. Однако имеющиеся в литературе данные весьма противо­ речивы. При изучении поверхностного натяжения белковых раст­ воров Булл и Нейрат [142] обнаружили минимальное значение поверхностного натяжения в изоэлектрическом состоянии и су­ ществование максимальных значений в кислой и щелочной об­ ластях. Гаузер и Свиринген [143], изучая поверхностное натяжение 0,005 %-ного водного раствора яичного альбумина на границе с воздухом, нашли минимальное значение поверхностного натяже­ ния в изоэлектрической точке и увеличение поверхностного натя­ жения при отклонениях от нее. После старения слоя эти законо­ мерности становятся более четко выраженными.

Рассмотрим влияние электрических зарядов на кинетику об­ разования и прочность адсорбционных слоев яичного и сывороточ­ ного альбуминов и казеина на границах с воздухом и с маслом. В кислых и щелочных областях от изоэлектрической точки на­ блюдалось замедление нарастания прочности межфазных адсорб­ ционных слоев. В этом сказывается большое влияние зарядов на процесс адсорбции и на взаимодействие отдельных молекул друг с другом. Нарастание прочности адсорбционных слоев яичного альбумина на границе с воздухом показано на рис. 33 при разных

208

pH и различных временах старения слоев. На рис.’ 33 представле­ ны зависимости равновесных значений прочности адсорбционных слоев от pH для разбавленного раствора яичного альбумина (0,005 г/100 мл) на границе с бензолом. При низкой концентрации белка в водном растворе наблюдается ярко выраженная зависи­ мость прочности межфазных слоев от pH при всех температурах и даже при добавлении 0,1 N КС1. При повышении температуры вследствие увеличения кинетической энергии молекул предельное значение прочности наблюдается уже через 30 мин, при 55° G зависимость прочности адсорбционного слоя от pH сглаживается.

В случае малых концентраций яичного альбумина по мере уда­ ления от изоэлектрической точки двухмерное давление оказывает­ ся не столь велико, чтобы преодолеть электростатические силы отталкивания. Электростатические силы отталкивания начинают преобладать над силами притяжения. Существование электриче­ ского барьера приводит к существенному уменьшению как адсорб­ ции, так и возможности образования межмолекулярных связей в слое. Зависимость «среднего времени жизни» от pH в интервале их значений 2,1—11,5 (однако кроме значения pH, соответствую­ щего изоэлектрической точке) лежит в довольно узком диапазоне времен (60—80 сек).

Зависимость Tt!t от pH в сравнении с прочностью межфазного слоя представлена на рис. 34. В кислой и щелочной областях при относительно небольших прочностях межфазного слоя яичного альбумина время жизни составляет десятки секунд. Затем в изо­ электрической области (когда наблюдается резкое повышение про­ чности межфазных слоев) время жизни капель бензола на этих границах также возрастает — найденное Хуг составляет более

3 час.

На рис. 35 показана зависимость прочности межфазного ад­ сорбционного слоя а-казеина на границе с бензолом от pH водного раствора белка. Видно, что с возрастанием pH среды от 6 до 12 прочность межфазного слоя увеличивается от 0,2 до 1,2 дин!см- (см. рис. 35, кривая 2). В хорошем согласии с этими данными на­ ходится зависимость удельного оптического вращения а-казеина от pH (см. рис. 35, кривая 3)\ [a]D при возрастании pH увеличи­ вается от —70° до —110°, что свидетельствует о развертывании полипептидных цепей по мере накопления отрицательных зарядов на молекулах a-казеина. Развертывание макромолекул а-казеина в растворе приводит к тому, что при адсорбции на границе фаз мак­ ромолекулы дают максимально возможное число межмолекуляр­ ных связей, что и ведет к повышению прочности адсорбционного слоя при высоких pH [144].

Из рис. 36, на котором представлены данные изменения проч­ ности, абсолютной величины зарядов [145], поверхностного на­ тяжения, вязкости и удельного оптического вращения в водных растворах ЧСА в зависимости от pH, видно, что изменение меж­ фазной прочности лучше всего коррелирует с изменением зарядов

209