книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

туре имеют реакционноспособные группы, расположенные на­ столько близко друг к другу, что при реакции с хромовыми квас­ цами происходит внутримолекулярное сшивание макромолекул. Можно также сделать вывод о том, что структура беспорядочно свернутого клубка, по-видимому, достаточно компактна, во вся­ ком случае настолько, насколько это необходимо для осуществле­ ния внутримолекулярного сшивания.

Из описанного выше поведения макромолекул желатины оче­ видно, что взаимодействие между ними и характер упорядоченных структур, образующихся при взаимодействии, зависит от двух важных факторов: 1) специфических свойств и реакционной спо­ собности макромолекул, обусловленных линейной последователь­ ностью аминокислотных остатков и определяющих специфический тип спирализации этих цепей; 2) среды, окружающей макромо­ лекулы, которая определяет преимущественный тип взаимодействия молекул в системе.

Рис. 4. Зависимость темпера­ турного коэффициента удель­ ного оптического вращения гелей желатины от температу­ ры при различных pH

1 — 10; 2 — 4, 9; 3 — 3,0

Рис. 5. Зависимость оптиче­ ского вращения раствора же­ латины от температуры (кон­ центрация желатины 0,5 г/100

мл)

Рис. 6. Эффект фиксирования желатины в конформации клуб­ ка (1) и спирали (3) при добав­

лении хромовых квасцов по сравнению с обычным раство­ ром желатины (2)

71

Исследование тепловых эффектов при гелеобразовании

Вопрос о тепловом эффекте гелеобразования желатины ока­ зался особенно дискуссионным в связи с трудностью измерения небольших тепловых эффектов в процессе структурообразования. Нейман, Николаев и сотр. [98—103] рассматривали переход золь — гель в желатине как процесс, аналогичный переходу стекло — жидкость, и подтверждали отсутствие фазового пере­ хода при гелеобразовании опытами, где не наблюдалось тепло­ вого эффекта и изменения объема при образовании структуры геля. С другой стороны, в работах Лоттермозера [104] и Липатова с сотр. [60, 61, 105, 106] было показано, что процесс застудневания подобен кристаллизации и сопровождается тепловым эффектом.

Трудность измерения теплового эффекта при гелеобразовании желатины связана с небольшой его величиной, для определения

мопары с визуальным отсчетом и с применением фотозаписи при помощи саморегистрирующего пирометра Курнакова. Эти ме­ тоды и приборы оказались недостаточно точными и чувствитель­ ными для измерения тепловых эффектов при гелеобразовании, и поэтому дальнейшие термохимические исследования гелей же­ латины велись по измерению теплот набухания и растворения, а также по измерению теплоемкости гелей с использованием чув­ ствительных калориметров. Эти исследования и выявили, что теплоты растворения и набухания гелей желатины зависят от температуры, тогда как для термолизованной желатины эта за­ висимость не наблюдалась. Теплота плавления геля, полученная из температурной зависимости величины предельного набуха­ ния, равна 3,75 кал/г белка [61], однако калориметрические исследования теплот растворения студня желатины в 8 М рас­ творе мочевины дали теплоту плавления 9 кал/г [110].

Исследования теплоты растворения гелей желатины в широком интервале температур показали, что плавление гелей сопровожда­ ется поглощением скрытой теплоты в сравнительно узком ин­ тервале температур. Эти данные, а также дилатометрические измерения, показавшие, что при плавлении гелей желатины на­ блюдается изменение объема [111], позволили рассматривать про­ цесс плавления гелей желатины как фазовый переход, связанный

скооперативным процессом разрушения структурной сетки геля

[112].Введение 8 М мочевины в исследуемую систему, которая разрушала структуру геля, снижало температуру и теплоту плав­ ления гелей, а также смещало скачок температурного коэффи­ циента объемного расширения гелей в сторону более низких тем­ ператур. Характер перехода гелей в расплавленное состояние оп­

ределялся фазовым состоянием полимеров, из которых образовыва­ лись гели [И З—115].|

72

Создание более совершенного вакуумного адиабатического ка­ лориметра с автоматическими регулируемыми тепловыми шир­ мами позволило Бурджанадзе, Привалову и Тавкелидзе [116] определить теплоту плавления гелей желатины прямо из кало­ риметрических измерений и получить более точную зависимость теплопоглощения от температуры, ранее определенную лишь качественно термографическим методом. Теплота плавления, оп­ ределенная этим методом, равнялась 5 ккал/г сухого вещества. На графиках зависимости теплоемкости от температуры выявля­ лись два максимума, которые отражали сложность процесса плав-

Рис. 7. Схема микрокалориметра типа «Кальве»

1 — металлический блок;

2 — внешняя оболочка калориметри­ ческих элементов;

S — внутренняя оболочка калоримет­ рических элементов;

4— термобатарея;

5— реакционная камера; в — конус;

7 — электрическая печь; S — прокладка из асбеста

ления геля желатины. Первый максимум соответствовал стадии разрушения пространственной структуры геля, ведущей к вы­ свобождению отдельных агрегатов. Второй максимум представ­ лял стадию распада агрегатов. Полная теплота, поглощаемая при нагревании желатины, полученной денатурацией проколлаге­ на, была равна 2,44 + 0,06 кал!г и составляла всего 30% от полной теплоты денатурации нативного проколлагена (8,4 кал/г). На этом основании можно предположить, что при охлаждении желатины вновь образуется одна треть разорванных при денатурации связей.

Калориметрические исследования тепловой денатурации про­ коллагена показали [115], что вместе с тем типом структур, которые имеются в нативном проколлагене и интенсивно плавятся в области 30—34° и 35—39° С, в охлажденном денатурированном

тервалом плавления гелей желатины. Меньшая степень коопера­ тивное™ процесса плавления свидетельствует о меньшей степени упорядоченности структуры желатины. Величины тепловыделе­ ния, полученные тем или иным способом (непосредственно по теплотам плавления или рассчитанные из температур плавления), составляли несколько десятков килограммкалорий на моль. Небольшие отличия, получаемые в разных опытах, можно, повидимому, объяснить различием некоторых сортов желатины и

73

предысторией приготовления образцов. Тем не менее все эти ре­ зультаты свидетельствовали о том, что процесс плавления гелей сопровождается фазовым переходом.

Для исследования процессов структурообразования в водных растворах желатины нами впервые был применен микрокалори­ метр типа Кальве [116, 117]. Это позволило измерять тепловые эффекты в течение длительного времени и таким образом изучать кинетику структурообразования желатины, а также судить о фазовых превращениях при гелеобразовании. Микрокалориметр типа Кальве, изготовленный на кафедре общей химии МГУ1 (рис. 7), с успехом применялся для изучения как физико-хими­ ческих, так и биологических систем [118, 119].

Принцип действия микрокалориметра основан на том, что тепло, выде­ ляющееся в нем, выводится из калориметрической камеры и действует на термопары, окружающие камеру. При достаточно большом числе термопар, равномерно окружающих калориметрические элементы, электродвижущая сила детекторной термобатареи будет прямо пропорциональна измеряемому общему потоку тепла, исходящему из калориметрической камеры. В калори­ метре имелись две камеры, одна из которых являлась рабочей, другая — сравнительной. Дифференциальные термобатареи изготовлялись из плати­ но-родиевых и золото-палладиевых проволок диаметром 0,2 лш, термобата­

рея имела 52 пары спаев, 16 из которых служили для получения эффекта Пельтье, применяемого для термоэлектрического охлаждения и нагревания.

Для расчетов тепловыделения в микрокалориметрическом методе Каль­ ве использовалось уравнение Тиана

(3)

где W — тепловая мощность, выделяющаяся в калориметрической камере

в момент т.

Эта тепловая мощность Р() частично теряется в форме потока тепла, исхо­

дящего из камеры.

Другая часть тепла, р (dO/dx), сохранившаяся в калориметре, вызывает повышение температуры внутренней оболочки на dQ в течение времени dr.

В уравнении (3) Р — константа прибора, равная 0,0002 кал/мин-мкв,

характеризующая калориметрическую чувствительность прибора; 0 = 0* — 0j — разность температур внутренней и внешней оболочек калориметра; р — «кажущаяся теплоемкость» содержимого внутренней оболочки кало­ риметра.

Обозначив через А отклонение гальванометра в каждый момент т, имеем

1 Авторы приносят глубокую благодарность доценту В. А. Холлер за лю­ безно предоставленный прибор и консультации при проведении опытов.

Вся теплота, выделившаяся при гелеобразовашш, рассчитывалась ио интегральному уравнению Тиана:

где А — показания детекторной термобатареи, мкв; ц — тепловое значение калориметра; А — площадь под опытной кривой; Ai и Д2 — значения экс­

периментального нуля в начале и в конце опыта.

р (Дг — Д1) = 0, так как Дг = Дг.

Измерение площади производилось методом взвешивания. Ка­ лориметрическая чувствительность прибора составляла 5,5-10-5

Нами на микрокалориметре типа Кальве измерялось тепло­ выделение во времени при структурообразовании гелей желатины концентрации 5—40 г/100 мл при 25° С и pH 4,9. Для геля же­ латины концентрации 10 г/100 мл измерения проводили при pH 3 и pH 9, а также в растворах 10%-ного салицилата натрия и 7 М мочевины. Опыты по измерению тепловыделения начинались после установления в калориметре теплового равновесия (экс­ периментального нуля). После установления в приборе экспери­ ментального нуля в рабочую пробирку наливалось 8 мл раствора желатины, предварительно нагретого до 60° С и выдержанного при этой температуре 30 мин. Затем пробирка охлаждалась в термостате при 25° С в течение 5 мин и в течение 15 мин приво­ дилась к экспериментальному нулю. За время опыта т, равное 24 час, снимались показания термобатареи в микровольтах.

На термограммах, полученных для гелей желатины различной концентрации (10—40 г/100 мл) (рис. 8), видно, что процесс структурообразования желатины идет с выделением тепла. Тепловыделе­ ние достигает максимального значения через 50 мин после начала опыта. Чем выше концентрация желатины, тем наблюдается боль­ ший тепловой эффект. Система приходила к экспериментальному нулю через 10—12 час. При дальнейшем наблюдении в течение 3 суток не удалось зафиксировать какое-либо тепловое изменение системы.

Теплоты гелеобразования рассчитывались из опытных данных по уравнению (5). Ниже приведены величины теплот структуро-

Теплоты гелеобразования желатины, полученные нами из опытных данных, согласуются с теплотами, рассчитанными Ме-

75

ерсон и Липатовым [71], а также с теплотами, вычисленными Элдриджем и Ферри [120] и Пурадье [121]. Таким образом, гелеобразование желатины сопровождается тепловым эффектом,

равным 49—58 ккал/молъ.

Для всех изученных гелей желатины наблюдалось тепловыде­ ление в процессе образования структуры. Однако можно было ожидать отсутствия тепловыделения в тех случаях, когда струк­ тура не образовывалась. Известно, что добавление мочевины и

салицилата натрия разрушает структуру геля желатины. Дейст­ вительно, в этих случаях тепловыделение не наблюдалось для гелей желатины при с — 10 г/100 мл.

Тепловые эффекты гелеобразования желатины, определенные прямым методом, согласуются с ранее известными в литературе косвенными оценками теплот образования гелей желатины, по­ лученными при определении теплот и температур плавления гелей. Совокупность рассмотренных данных позволяет сделать вывод о том, что гелеобразование желатины можно рассматривать как фазовый переход.

Определение температур плавления гелей желатины

Вопрос о природе связей, ответственных за образование трех­ мерной сетки геля в растворах желатины, до сих пор еще окон­ чательно не решен [67], а существующие взгляды противоречивы. Основная роль приписывается либо взаимодействию между по­ лярными группами с образованием водородных или солеобразных связей [59, 122—124], либо гидрофобным взаимодействиям [125]. Высказывалось мнение, что в студнеобразовании участвуют все перечисленные типы связей [67]. Последняя, по-видимому, наи­ более правильная точка зрения, однако она нуждалась в даль­ нейшем выяснении роли отдельных типов связей в процессе структурообразования. Следующий раздел посвящен изучению влияния

76

концентрации, pH, ионной силы и добавок мочевины на темпера­ туру плавления гелей желатины. Температура плавления гелей может служить мерой прочности связей молекул желатины и агрегатов друг с другом при образовании трехмерной сетки.

Ранние работы по исследованию температур плавления гелей желатины страдали непоследовательностью и часто были противо­ речивы, вероятно, из-за отсутствия ясного представления о конформационном состоянии желатины и о термической предысто­ рии гелей [64]. Температура плавления гелей желатины измерялась по разработанной нами методике [72].

Раствор желатины нагревали до 50° С и вводили при помощи тонкооттянутой пипетки в стеклянную трубку (рис. 9, а) через скошенный конец ее

до метки. Во время заполнения трубка находилась почти в горизонтальном положении. После заполнения трубку погружали в металлическую чашеч­ ку с частично замороженным бензолом (рис. 9, б) и выдерживали в ней в те­ чение 2 мин. Трубку с застывшей желатиной помещали в вертикально уста­

новленную пробирку (рис. 9, в), и в середину столбика желатинового геля вводили безынерционную термопару. Термопара медь—константан была сде­ лана из проволочек диаметром 0,1 мм и соединялась с зеркальным гальвано­

метром М-95, шкала которого была проградуирована в градусах Цельсия (точность отсчета была 0,2°). Вначале температуру геля медленно повыша­ ли за счет комнатной температуры, а затем, если это было необходимо, пу-

ТТ— <Ps = 4 m m

Рис. 9. Схема определения температуры плавления гелей желатины

тем подогревания пробирки погружением ее в воду (предварительно подогре­ тую до 50°). За температуру плавления геля принимали температуру, соот­ ветствующую началу образования капли раствора желатины на скошенном конце трубки; отмечали также температуру, соответствующую моменту па­ дения первой капли. Многочисленные измерения показали, что плавлоги; геля желатины происходит в достаточно узком интервале, который не пре­ вышает 1° и хорошо воспроизводим.

77

78

температуру плавления гелей тех же концентраций, но с разными ионными силами при pH 2—11. Результаты представлены на рис. И . Кривая 7 для геля концентрации 0,6 г/100 л/л через 20 час показыва­ ет, что в определенных зонах pH гель не образуется, однако уже че­ рез четверо суток гель образуется при всех pH (кривая 2). Следова­ тельно, одноименный заряд молекул желатины замедляет обра­ зование геля, что также подтверждается кривой 3 для геля, вы­ держанного в течение 20 час. Однако при добавлении в систему 0,1 N NaCl видно, что при pH 5 температура плавления ниже, чем в изоэлектрической точке и в щелочной области, по-видимому, в связи с тем, что в кислой области свободный заряд выше [137]. Зависимость температуры плавления геля (с = 2 г/100 мл) от pH представлена на кривой 4.

Добавление NaCl (кривые 5 и 6) несколько понижает темпе­ ратуру плавления этих гелей. Это связано с тем, что в присутствии соли улучшаются условия образования коллагеноподобных спи­ ралей желатины, что приводит к уменьшению числа связей между гелеобразующими частицами. Таким образом, взаимодействие ионогенных групп влияет на образование гелей желатины. Вклад этого взаимодействия не является, однако, основным.

Добавление 8 М раствора мочевины к растворам желатины (в области концентраций 2—20 г/100 мл) не приводило к структурообразованию [18]. На кривых 8 и 9 рис. 11 представлены результаты для гелей концентрации 30 и 50 г/100 мл. Изменение pH в обе стороны от изоэлектрической точки понижает темпера­ туру плавления. Добавление 8 М раствора мочевины в этом слу­ чае не препятствует структурообразованию, а приводит лишь к понижению температуры плавления. Для геля концентрации 30 г/100 мл температура плавления понижалась примерно на 7°, а концентрации 40 г/100 мл — на 10°. Определение удельного оптического вращения показало, что в этом случае молекулы желатины находятся в состоянии статистического клубка [138]. Следовательно, в образовании и стабилизации гелей желатины при высоких концентрациях сильно возрастает роль гидрофобных связей. Гидрофобные связи — это ассоциирование неполярных групп молекул друг с другом на расстояниях, гораздо больших суммы их ван-дер-ваальсовых радиусов, приводящее к возникно­ вению агрегатов из неполярных участков молекул с максимально сокращенным числом контактов молекул воды с неполярными группами.

Из данных по тедшературам плавления гелей можно рассчи­ тать тепловые эффекты гелеобразования. Элдридж и Ферри [120], принимая, что в реакции гелеобразования 2 моля поперечно свя­ зываемых участков соответствуют 1 молю межмолекулярных

79