книги из ГПНТБ / Измайлова В.Н. Структурообразование в белковых системах

стадией образования зародышей. Аналогичные закономерности отмечались и ранее в работе Влодавца, Ребиндера и сотр. [18] при изучении образования аморфной фазы из метастабильных раство­ ров полимеров. Образование новой фазы в лиофильных полимер­ ных системах облегчено по сравнению с лиофобными тем, что меж­ фазное натяжение на границе сравнительно невелико, а это значи­ тельно снижает энергетический барьер, преодоление которого не­ обходимо для образования зародышей новой фазы.

В отличие от водных систем желатины, для которых объемное структурообразование можно наблюдать в широком диапазоне pH, гелеобразование в водных растворах яичного альбумина происхо­ дит лишь при денатурации белка в кислых и щелочных областях pH. При pH ниже 3 и выше 10 молекулы яичного альбумина, полипептидная цепь которых в нативном состоянии содержит при­ мерно 30% а-спиральных участков и уложена в компактную гло­ булу, претерпевают глубокие конформационные изменения, при­ водящие к потере нативных свойств молекул и к образованию не­ упорядоченных клубков.

лГлобулярная пространственная структура белков в значитель-

1 ной мере стабилизована гидрофобными взаимодействиями неполяр-

Iных аминокислотных остатков. Энтальпия перехода из разверну­ того состояния в свернутое невелика, уменьшение же энтропии при переходе развернутой полипептидной цепи в свернутое компактное состояние компенсируется выигрышем энтропии в результате сок­ ращения контактов неполярный остаток — вода. Процесс денату­ рации можно рассматривать как изменение окружения неполярных аминокислотных остатков от неводного окружения к водному. При этом резко увеличивается число контактов неполярных боковых групп с молекулами воды, что должно вызывать дополнительное структурирование воды и приводить к возрастанию свободной энергии системы. Возникновение множества случайных межмоле­ кулярных гидрофобных взаимодействий, осуществляющихся при столкновениях денатурированных макромолекул, приводит к сни­ жению свободной энергии системы. В результате протекающих при этом процессов макромолекулы белков частично теряют раст­ воримость и в растворах появляются агрегаты макромолекул, на­ копление которых обусловливает в дальнейшем возникновение прочных объемных дисперсных структур [301, 302].

Скорость процессов денатурации молекул яичного альбумина при pH, далеких от изоточки, в значительной мере зависит от тем­ пературы. Из измерений удельного оптического вращения было найдено, что выдерживание растворов яичного альбумина при 55° С в течение 2 час приводит к полному переходу молекул белка в бес­ порядочные клубки [301, 302].

При исследовании структурообразования в водных растворах яичного альбумина при 55° С обнаружено, что при концентрациях белка выше 4,5 г/100 мл временные зависимости прочности прохо­ дят через максимум, после достижения которого наблюдается сни­

130

жение прочности. Быстро образующийся гель самопроизвольно растрескивается, что, вероятно, связано с возникновением внут­ ренних напряжений в системе вследствие одновременного протека­ ния процессов формирования каркаса трехмерной структуры и де­ натурации молекул яичного альбумина. Это может служить при­ чиной разрыва уже образовавшихся связей между агрегатами. Действительно, если образование геля происходит медленно, на­ пример при кислотной денатурации (при комнатной температуре), то предельная прочность возникающей структуры со временем не уменьшается.

Макромолекулы казеина и его а- и ^-фракции в основном на­ ходятся в конформации статистического клубка (90—98%), и лишь небольшая доля полипептидных цепей имеет конформацию а-сцирали и ^-структуры [249,282]. Гелеобразование в водных раст­ ворах казеина отчетливо проявляется только при больших кон­ центрациях белка и высоких pH. Результаты исследований зави­ симости оптического вращения от pH показали, что в щелочной области pH молекулы казеина находятся в наиболее развернутом состоянии, следовательно, обладают повышенной склонностью к агрегации и образованию пространственных сеток.

Индукционный период структурообразования в водных дис­ персиях казеина в области pH 12—13 минимален, тогда как при pH 8 прочные пространственные структуры не возникают совсем (индукционный период равен бесконечности), хотя в обоих случаях в течение некоторого времени можно наблюдать протекание конформационных изменений макромолекул и формирование агрега­ тов, нерастворимых в водной среде и являющихся элементами трех­ мерной структуры малой прочности. На второй стадии происходит дальнейшая агрегация частиц, число связей между ними увеличи­ вается и прочность системы достигает максимального значения (че­ рез 10—12 суток при pH г=г 12).

Конформационные изменения и процессы взаимодействия мак­ ромолекул белков, а также характер структур, образующихся при таком взаимодействии, определяются двумя основными факто­ рами: 1 ) специфическими свойствами макромолекул, определяе­ мыми линейной последовательностью аминокислотных остатков, типом спирализации и пространственной укладкой всех полипеп­ тидных цепей; 2 ) условиями, которые могут вызвать тот или иной из разнообразных типов изменений взаимодействий, возможных при данной внутренней структуре макромолекул. Такие изменения приводят к образованию дисперсных пространственных структур либо в связи с денатурацией (яичный альбумин, казеин), либо в связи р процессом ренатурации — образованием коллагеноподоб­ ных спиралей (желатина).

Сравнение результатов по кинетике образования пространствен­ ных структур различных белков, первоначально имеющих раз­ личную конформацию макромолекул в водном растворе, с резуль­ татами определения предельной прочности трехмерных структур

5* 131

понизило, что существуют оптимальные времена выделения новой фазы. Медленное выделение новой фазы приводит к образованию крупных частиц н в результате к малому числу контактов между частицами. Очень же быстрое выделение новой фазы приводит к образованию структур с внутренними напряжениями, которые самопроизвольно разрушаются.

Для возникновения дисперсной пространственной структуры необходима определенная критическая концентрация макромоле­ кул белка. Для водных растворов желатины она равна 1, для яич­ ного альбумина — 2, для казеина — 15 г/100 мл (при 20° С). Раз­ личная критическая концентрация, необходимая для образования пространственных структур в разных белках, обусловлена специ­

латины соотношение полуосей равно 50—70 при Mw = 70 000, для яичного альбумина после денатурации соотношение полуосей -5 ? 70 при Л/ w = 35 000. При критической концентрации гелеобра-

1зования желатины также наблюдалась и наибольшая асимметрия светорассеяния, что характеризует большую асимметрию агрега­ тов. Существование критической концентрации при гелеобразова-

t нин белков связано с тем, что структурообразование осуществля­ ется лишь при достижении определенной концентрации фазовых частиц, обеспечивающей возникновение необходимого для под­ держания прочной объемной структуры числа контактов между та­ кими частицами.

Исследование кинетики гелеобразования показало, что ско­ рость нарастания прочности гелей тем больше, чем выше концент­ рация болка в системе. Эта скорость для гелей желатины наиболь­ шая, когда макромолекулы находятся в изоэлектричестшм. спстоянии, и уменьшается при переходе в кислую.и-щедочную область. Образование структур из водных растворов казеина наблюдается только при высоких pH (оптимум pH 12—13), а в водных раство­ рах яичного альбумина — при низких значениях pH (оптимум

Р Н < 3 ) .

Исследования зависимости предельного напряжения сдвига от концентрации белка в водной системе позволили обнаружить квадратичную зависимость этой механической характеристики от концентрации белка [64, 304, 305J.

Данные по измерению интенсивности рассеянного света и его дисперсии позволили проследить за развитием новой лиофильной фазы при образовании геля. На рис. 49 представлены зависимости интенсивности светорассеяния, температуры плавления и предель­ ного напряжения сдвига от концентрации желатины. При увели­ чении концентрации желатины светорассеяш:е увеличивается, а затем уменьшается (в согласии с данными Доти и Вейса). Макси­ мальное значение светорассеяния совпадает с концентрацией геле­

132

образования zz 1 г/100 мл. Рост прочности, уменьшение светорас­ сеяния и повышение температуры плавления гелей при увеличении концентрации желатины дают основание предположить, что с уве­ личением концентрации образовавшаяся сетка геля приобретает более упорядоченную трехмерную структуру. Появление упоря­ доченной структуры геля с увеличением концентрации желатины подтверждается рентгенографическими исследованиями [185].

Возможность образования упорядоченных кристаллических структур в полимерных системах при высоких концентрациях была доказана экспериментально в работе Френкеля и сотр. [166] (для

Рис. 49. Зависимость пре­ дельного напряжения сдви­ га (1), температур плавле­

ния (2) и интенсивности светорассеяния растворов гелей желатины в 0,15 N NaCl (3) и в 8 М растворе мочевины (4) от концентра­

ции желатины при pH 4,9 и 20° С (концентрация с, г/100 мл и Рк даны в лога­

рифмическом масштабе)

поли-у-1 /-бензилглютамата), где методом дифрактометрии было по­ казано упорядочение агрегатов в течение длительного времени (4 месяца) при неизменности конформационного состояния макромо­ лекул. Интенсивность светорассеяния с ростом концентрации же­ латины в присутствии 8 М раствора мочевины незначительно уве­ личивается (см. рис. 49, кривая 4), однако остается на порядок меньше соответствующей величины без мочевины. Структура в таких системах также не возникала.

Сложная зависимость интенсивности светорассеяния от кон­ центрации желатины (до 20 г/100 мл) наблюдается и при 40ч С, когда макромолекулы находятся в состоянии статистического клуб­ ка. Интенсивность светорассеяния растворов желатины при добав­ лении 8 М водного раствора мочевины при тех же условиях зна­ чительно меньше. При 40° С по мере увеличения концентрации желатины все большую роль приобретают гидрофобные взаимо­ действия макромолекул. Наличие гидрофобных областей в макро­ молекулах желатины при 40° С было показано в нашей работе [39] при исследовании солюбилизации углеводородов в этих условиях.

Сложную концентрационную зависимость светорассеяния в условиях гелеобразования, по-видимому, нельзя объяснить только изменением объемного заполнения системы и следует учитывать закономерности возникновения агрегатов, их размеры, возможные конформационные изменения макромолекул в агрегатах, специфи­

133

Пересыщенных растворов при образований прочных структур гелей желатины. При добавлении к раствору желатины 8 М водного раствора мочевины интенсивность светорассеяния (кривая 2), удельное оптическое вращение (кривая 3) и предельное напряже­ ние сдвига (кривая 1) не зависят от температуры. Эти результаты показывают, что при больших концентрациях мочевины в системе не образуются агрегаты, не возникают участки коллагеноподобных спиралей и не происходит гелеобразования.

Понижение температуры приводит к резкому увеличению свето­ рассеяния, что свидетельствует о выделении новой фазы в процессе гелеобразования. Выделившаяся новая фаза является элементом структуры прочного геля. Однако прочный гель может образовы­ ваться только при достаточно быстром выделении новой фазы из пересыщенного раствора, когда между возникающими частицами возможно образование контактов. Выделение фазы в равновесных условиях может и не привести к образованию прочности, как это имеет место при образовании коацерватов или тиксотропном вос­ становлении гелей. Сравнительно небольшая прочность тиксотроп­ но восстановившегося геля обусловлена гидрофобными взаимодействями между частицами.

Взаимодействие между агрегатами макромолекул белков приводит к образованию прочной пространственной структур!!. Кон­ такты между частицами выделяющейся "фазы могут осуществляться за счет образования водородных связей, а также вследствие гид: рофобных взаимодействий между неполярными участками макромолекул. Взаимодеиствйё~1к«зжду ионогенными группамидне двля-— ется основным в процессе гелеобразования и влияет только на ско­ рость гелеобразования__

Проведенные исследования позволяют предложить следующий механизм образования гелей белков. При соответствующих темпе­ ратурах в растворах белков совершается конформациспк^й. пере­ ход макромолекул. Этот процесс сопровождается образованием аг­ регатов макромолекул, которые являются частицами дисперсной лиофильной фазы. Накопление таких частиц приводит к возникно­ вению контактов между ними и появлению объемной структуры геля, характеризующейся определенными твердообразными ме­ ханическими свойствами.

По классификации Ребиндера [1—3], пространственно струк­ турированные системы можно разделить на два типа: коагуляцион­ ные (тиксотропно обратимые] со слабыми структурными связями и , конденсационножристадлизационные (необратимо разрушающиеся) с сильными связями. Для выяснения типа структуры, возника­ ющей в гелях белков, исследойалось нарастание прочности в струк­ туре,, разрушенной на равных этапах ее формирования.

В гелях яичного альбумина после повторных разрушений проч­ ность практически полностью восстанавливается во времени. Тик­ сотропные свойства гелей яичного альбумина подтверждались сня­ тием полных реологических кривых на приборе Шведова. Вязкость

135

разрушенной структуры на восемь порядков ниже неразрушенной. После снятия нагрузки система полностью тиксотропно восстанав­ ливалась во времени. Большой вклад гидрофобных связей в обра­ зование трехмерной структуры яичного альбумина, вероятно, и обусловливает тиксотропность.

Таким образом, в гелях яичного альбумина возникает слабая структуру, подобная обычным тиксотропным коагуляционным структурным сеткам, в которых частицы дисперсной фазы и агре­ гаты макромолекул связаны ван-дер-ваальсовыми силами. В гелях яичного альбумина коагуляционные контакты, возникающие меж­ ду агрегатами макромолекул, обусловлены гидрофобными взаимо­ действиями в системе, в результате которых происходит слипание агрегатов по их неполярным участкам в соответствии с известными представлениями о'роли структуры воды в гидрофобных взаимо­ действиях.

Малоконцентрированные гели желатины представляют собой смешанный тип структуры (коагуляционно-конденсационный). В малоконцентрированных гелях желатины (0,7—3 г/100 мл) при 20° С после разрушения геля наблюдается процесс нарастания прочности, но возникающая вновь пространственная структура обладает меньшей прочностью, чем у неразрушенного геля. Воз­ никшие таким образом слабые структуры обнаруживают при пов­ торных разрушениях полную тиксотропию. После разрушения системы в них развиваются структуры с той же малой прочностью. Следовательно, эти системы являются коагуляционными структу­ рами. Коагуляционный характер на этом этапе подтверждается полной обратимостью структуры при механическом разрушении. Для образования коагуляционной структуры белковых гелей не­ обходимо наличие фазовых частиц, анизометричность этих частиц, мозаичность или дифильность структурных единиц. Общие свойст­ ва коагуляционных структур подробно рассмотрены одним из ав­ торов этой книги [4, 308].

При образовании коагуляционной сетки и отдельных ее эле­ ментов — агрегатов или цепочек в контакте между частицами оста­ ется весьма тонкая и равновесная прослойка жидкой дисперсион­ ной среды, толщина которой соответствует минимуму свободной энергии системы. Такие относительно устойчивые прослойки могут возникать и при двух различных значениях толщины, что соответ­ ствует слабому коагуляционному сцеплению при большей толщине и прочному (ближнему) — при наименьшей толщине [308, 309]. Такие остаточные тонкие прослойки жидкой среды аналогичны тем, которые образуются, как это впервые показал Фрумкин [310], при возникновении краевого угла смачивания по периметру пузырька

газа (водорода), прилипающего к поверхности ртути в водных ра­ створах.

Именно в связи с наличием тонких устойчивых прослоек жид­ кой среды в участках коагуляционного сцепления, препятствую­ щих дальнейшему сближению частиц, коагуляционные структуры

136

обладают характерными механическими свойствами. Это — пони­ женная прочность (на несколько порядков более низкая, чем до­ статочно высокая прочность при той же степени объемного запол­ нения, но при непосредственных контактах между частицами), пол­ зучесть даже при самых малых напряжениях сдвига, структурная вязкость, а в более концентрированных дисперсиях (пастах) — явная пластичность. С наличием тонких адсорбционно-пластифи- цирующих прослоек среды в контактах между частицами связана и полная тиксотропия коагуляционных структур — их способность обратимо разрушаться при механических воздействиях, постепен-

► - ••

lg E'’lduHCM~2) 1

lEjT/ftfA'J

но восстанавливаясь во времени до той же предельной прочности в результате броуновских соударений частиц по коагуляционным участкам. Тиксотропия коагуляционных структур позволяет уста­ новить для них в условиях практически однородного сдвига (на­ пример, в ротационных вискозиметрах с коаксиальными цилинд­ рами с узким зазором) полные реологические кривые зависимости эффективной вязкости от напряжения сдвига, т. е. от равновесной степени разрушения структуры в стационарном потоке. Такие кривые воспроизведены в прямом и обратном направлениях (ли­ шены гистерезиса) при условии, что время перехода будет доста­ точным для тиксотропного восстановления.

С этими особенностями коагуляционных структур связано и еще одно их замечательное свойство — способность к замедленной упругости, ярко выраженному упругому последействию, аналогич­ ному каучукообразной высокоэластичности. У эластомеров высокоэластичность, как это хорошо известно, связана с гибкостью мак­ ромолекул, с изотермическим уменьшением энтропии при выпрям­ лении длинной гибкой цепи молекулы и, наоборот, с увеличением энтропии при спонтанном свертывании макромолекул в клубок. Для коагуляционных же структур сдвиговая высокоэластичность наблюдается, как это установлено реологическими исследования­ ми, даже для совершенно жестких частиц дисперсной фазы, обра­ зующих пространственную сетку. Как показали Щукин и Ребиндер [311], при анализе экспериментальных данных Серб-Сербиной и Федотовой [312] высокоэластическое последействие в коагуляцион­ ных структурах связано с взаимной ориентацией анизометричных

137

частиц — палочек, пластинок или цепочек, образуемых изометричными частицами в направлении сдвига. Каждому значению де­ формации сдвига соответствует определенная степень ориентации, непрерывно возрастающая с деформацией. Если наложить на сис­ тему достаточно малое постоянное напряжение сдвига, не превы­ шающее пределы текучести, чтобы пространственная структура не испытывала остаточных разрушений, успевая тиксотропно вос­ станавливаться (в области практически неразрушенных струк­

по реологической кривой), то легко различить два деформацион­ ных процесса (рис. 51).

А. Развитие быстрой высокоэластической деформации с перио­ дом ретардации порядка 1 0 - 2 — 1 0 - 3 сек связано с поворотом частиц вокруг коагуляционных контактов без скольжения, лишь с уменьшением углов между осями частиц (рис. 52), что и приводит к повышенной степени ориентации, отвечающей данной деформа­ ции сдвига (е).

Б. Развитие медленной высокоэластической деформации с пе­ риодом ретардации 1 0 2 — 1 0 3 сек, вызванной не только поворотом частиц вокруг узлов контакта с уменьшением угла между ними,

скоростью звука (для обычных размеров образца уже за 1 0 -в сек), по порядку величины составляет 1 0 9 дин!см%, тогда как для завер­ шенной (квазиравновесной) быстроэластической деформации мо­ дуль Е2 имеет порядок 1 0 3 —1 0 s дин!см2, а равновесный модуль после завершения медленной высокоэластической деформации Е т еще в 2 —4 раза меньше, чем Е2. Соответствующие деформации об­ ратны модулям — е0/Р = IIEU eJP — 11Е2, гт!Р = 11Ет, таким образом, высокоэластические деформации коагуляционных струк­ тур в 103 раз и более превышают истинно упругие (см. рис. 51).

После разгрузки — удаления действующей силы происходит спонтанное восстановление недеформированного состояния во времени, исчезает быстрая, а потом и медленная высокоэластичес­ кая деформация. Это может быть объяснено только энтропийным характером соответствующих величин сдвиговых деформаций, а

138

— AF = TAS при обратной дезориентации частиц, — переходе к их беспорядочному расположению в структуре сначала путем од­ них поворотов, а затем дальнейших взаимных поворотов частиц с относительными смещениями, т. е. перемещениями участков кон­

фективной вязкости т] 0 порядка 1 0 8 пз, развивается истинно вязкое течение — стационарный процесс ползучести, которым вполне можно пренебречь при малых напряжениях сдвига за сравнительно короткие времена, достаточные для завершения даже медленной

где б — эффективный диаметр частиц; р — их плотность; с* — ве­ совая концентрация дисперсной фазы, %.

При дальнейшем уменьшении б до атомных размеров Е т рас­ тет, приближаясь к модулю истинной упругости (Ет —>Е0 да 109), рассчитанному по аддитивной зависимости для заданной пористос­ ти структуры. Кинетика развития и спада высокоэластической де­ формации не передается экспоненциальными уравнениями, выво­ димыми из механических моделей, а следует уравнениям с одной характеристической константой, выводимой из самых простых представлений: при Р = const

139