Дифференцировка лимфоцитов на кластеры дифференциации по поверхностным cd-маркерам

Изучение лимфоцитов начинается с их выделения из крови. Мононуклеарные лейкоциты (лимфоциты, моноциты) отделяют от других клеток крови (гранулоцитов и эритроцитов) центрифугированием в градиенте плотности специальной смеси препаратов (фиккол, верографин). Имеющие большую плотность эритроциты и гранулоциты образуют осадок на дне пробирки, а мононуклеарные клетки образуют кольцо на поверхности градиентной смеси, откуда могут быть перенесены в отдельную пробирку и отмыты от градиентной смеси. Дифференцировка популяций и субпопуляций лимфоцитов связана с выявлением поверхностных CD-маркеров – антигенов (табл. 19) с помощью соответствующих специфических антител. Суть метода заключается в связывании дифференцировочных антигенов (поверхностных CD-маркеров) лимфоцитов с моноклональными антителами и дальнейшим их окрашиванием антиглобулиновыми антителами, меченными флюрохромом (метод непрямой иммунофлюоресценции). Затем происходит подсчет меченых клеток.

Таблица 19

Количественное содержание лимфоцитов крови здоровых людей

Популяция/субпопуляция	CD-маркер	Относительное количествоклеток, %	Абсолютное количество клеток, 109/л
Лимфоциты (всего)		100	1,50-2,40
Естественные киллеры	16	6-20	0,10-0,60
Т-лимфоциты (всего)	3	55-80	0,80-2,20
Т-хелперы	4	31-51	0,60-1,60
(Т-киллеры, цитотоксические клетки)	8	19-37	0,30-0,80
В-лимфоциты	19	5-19	0,10-0,50
NK-клетки	16 56	6-26 7-31	0,09-0,6

Определение количества лимфоцитов разных популяций (субпопуляций) по поверхностным маркерам проводится с помощью двух методик:

• Люминесцентной или световой микроскопии мазков крови или взвеси мононуклеаров, обработанных соответствующими моноклональными антителами, меченными флюорохромом или ферментом (для одного образца занимает неделю);

• Автоматического подсчета клеток с использованием проточного цитофлюориметра (для одного образца занимает несколько часов).

В крови у взрослых содержание Т-лимфоцитов (CD3⁺-клетки) обычно составляет 1,1-1,7·10⁹/л (56-78%). Повышенное их количество свидетельствует о гиперреактивности иммунитета, что также наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Снижение абсолютного числа Т-лимфоцитов говорит о недостаточности клеточного иммунитета, что довольно часто встречается при воспалениях разнообразной этиологии. Повышение числа Т-лимфоцитов в динамике заболевания – клинически благоприятный признак. Полное завершение болезни обычно сопровождается и нормализацией количества Т-лимфоцитов.

Увеличение абсолютного числа CD4⁺-клеток (Т-лимфоциты-хелперы) свидетельствует о стимуляции иммунной системы каким-либо антигеном и служит подтверждением гиперреактивных синдромов. Снижение числа Т-хелперов говорит о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета. Особенно наглядно это определяется при ВИЧ-инфекции. Повышение количества CD8⁺-клеток (цитотоксических Т-лимфоцитов) определяется практически при всех вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Относительное увеличение CD8⁺-клеток обычно обусловлено уменьшением числа Т-хелперов, хотя такую закономерность наблюдают не всегда. Уменьшение количества цитотоксических Т-лимфоцитов служит подтверждением недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета, что особенно важно при лечении хронических вирусных заболеваний (вирусных гепатитов, герпеса и др.).

Снижение количества NK-клеток – признак клеточно-эффекторного иммунодефицита, обусловленного онкологическими заболеваниями и тяжелыми вирусными инфекциями, приемом иммунодепрессантов. Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, т.е. является признаком клеточно-опосредованной цитотоксичности.

В настоящее время типируются и другие маркеры, их сейчас насчитывается около 250 разновидностей. Особенно это важно в онкогематологии для уточнения диагноза.