2. Указания к занятию:

1. Внимательно изучите инструкцию.

2. Приготовьте рабочие растворы для биохимического исследования активности α-амилазы в биологических жидкостях.

3. Осмыслите ход выполнения лабораторной работы.

4. Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, с приборами.

5. При работе с пипетками используйте резиновую грушу с переходником. Работайте в перчатках!

3. Практическая часть.

1. Приготовление рабочих растворов.

1. Буфер – субстрат.

Ход приготовления. Из набора реактивов во флакон № 2 (цветной крахмальный субстрат) отмерить точно 5,0 мл реактива № 1 (буфер) и 45 мл дистиллированной воды. Закрыть флакон, взболтать до образования однородной суспензии без комков. Затем поместить реактив на 30 минут в термостат при 37°С для завершения набухания субстрата. Хорошо перемешанный реактив не должен забивать пипетку.

Стабильность реактива в закрытом флаконе не менее 7 дней при комнатной температуре и месяца при (+2° – +8°)°С.

2. Осаждающий раствор (реактив № 3) – готов к использованию.

Примечание: Буфер-субстрат перед каждым дозированием необходимо сильно встряхивать несколько секунд. Использование расслоившейся суспензии не допускается, так как приводит к искажению результатов.

2. Лабораторная работа № 1. Определение общей активности α-амилазы в сыворотке крови методом «конечной точки».

ПРИНЦИП: α-амилаза разрушает нерастворимый цветной крахмальный субстрат с образованием синего, растворимого в воде красителя. Количество красителя в растворе после остановки реакции прямо пропорционально активности фермента. Активность амилазы выражена в международных единицах активности, где 1 ЕД – это количество амилазы, которое гидролизует 1 мкмоль субстрата за 1 минуту при 37°С совместно с бактериальной α-глюкозидазой.

Оборудование и реактивы: штатив с пробирками, центрифужные пробирки, дозаторы на 100 мкл и 50 мкл, пипетки градуировочные 1 мл и 2мл, стаканы, секундомер, термостат водный, спектрофотометр, центрифуга, фильтровальная бумага, воронки, вата; набор реактивов «Лахема» Россия.

Материал для исследования: сыворотка крови, моча.

Проведение анализа.

Длина волны 590 нм, кювета 1 см.

Реактивы	Опытная проба	Холостая проба
	В центрифужные пробирки внести:
1. Буфер – субстрат	1 мл	1 мл
	Инкубировать 5 минут при температуре 37°С.
2. Сыворотка крови (моча)	100 мкл или 50 мкл мочи	–
3. Дистиллированная вода	–	100 мкл или 50 мкл (для исследования мочи)
	Включить секундомер! Перемешать в течение 5 секунд и поставить в термостат на 15 минут.
4. Осаждающий раствор (реактив № 3)	2 мл	2 мл
	Перемешать! Выдержать пробирки при комнатной температуре 15 минут. При срочном анализе этот этап можно исключить. Центрифугировать 5 минут при 1500-3000 об/мин. Перенести надосадочную жидкость с помощью чистой пипетки в кювету.

Измерить оптическую плотность при длине волны 590 нм против холостой пробы.

3. Учет результатов при использовании сыворотки крови.

Исходя из полученного поглощения найти по приложенной калибровочной таблице активность α-амилазы в ЕД/л.

Учет результатов при использовании мочи.

При определении в моче найденную по таблице активность необходимо умножить на 2.

4. Референтные величины: сыворотка – 30 – 110 ЕД/л

моча – < 600 ЕД/л.