Исходный уровень знаний

Для усвоения материала темы необходимо знать структуру и функции нуклеиновых кислот, биосинтез белков (биохимия), строение клеток культуры тканей, строение куриного эмбриона (гистология), структуру, свойства и взаимодействие с клетками бактериофагов (микробиология).

Цель занятия

1. Изучить строение и культивирование вирусов.

2. Изучить принципы обнаружения и идентификации вирусов.

3. Показать разнообразие возбудителей острых респираторных вирусных инфекций.

4. Изучить строение, антигенные свойства вируса гриппа.

5. Освоить принципы лабораторной диагностики гриппа.

6. Научить классифицировать препараты для диагностики, лечения и профилактики гриппа

7. Изучить строение и свойства вирусов кори, эпидемического паротита, коронавирусов, аденовирусов, краснухи.

8. Изучить принципы лабораторной диагностики кори, эпидемического паротита, SARS, аденовирусной инфекции, краснухи.

9. Изучить вирусы семейства Herpesviridae, их свойства, разнообразие клинических проявлений герпетических инфекций.

10. Изучить принципы лабораторной диагностики герпетических инфекций.

11. Научиться классифицировать препараты для диагностики, лечения и профилактики в соответствии с темой занятия.

План изучения темы

1. Морфология, физиология и классификация вирусов.

2. Методы культивирования вирусов.

3. Методы обнаружения и идентификации вирусов.

4. Характеристика возбудителей гриппа.

5. Методы диагностики гриппа; лечение и специфическая профилактика гриппа.

6.Характеристика возбудителей парамиксовирусов, коронавирусов, аденовирусов.

7. Характеристика возбудителя краснухи.

8. Характеристика возбудителей герпетической инфекции.

9. Методы диагностики, специфической профилактики и лечения ОРВИ, краснухи, герпетической инфекции.

После изучения темы студент должен уметь

1. Исследовать в реакции гемагглютинации (РГА) полученную из заражённых куриных эмбрионов аллантоисную жидкость на присутствие вируса гриппа.

2. Учесть результаты идентификации выделенного вируса гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

3. Оценить результаты серодиагностики разных респираторных вирусных инфекций в РСК и РТГА.

4. Использовать методы лабораторной диагностики кори, паротита, краснухи для подтверждения клинического диагноза этих заболеваний.

5. Интерпретировать результаты серодиагностики кори, эпидемического паротита, краснухи.

6. Определить материал для лабораторной диагностики герпетических инфекций в зависимости от клинической формы заболевания и решить вопрос о методе лабораторного исследования (цитологический, ИФА, РИФ, ПЦР и другие).

7. Классифицировать иммунобиологические препараты по теме занятия в соответствии с их назначением.

Дополнительный материал к занятию

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов используют следующие методы:

1) заражение животных (внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, интраназально, заражение в мозг и другие);

2) на куриных эмбрионах после заражения их на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в амниотическую полость, в желточный мешок;

3) на культуре клеток различных тканей.

Культура ткани - это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определённым вирусам. Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются клетки с быстрым ростом и высоким уровнем обмена веществ. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др.), а также культуры тканей опухолей. Выращивание клеток культур тканей производят в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля и др.) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, пластинки стекла, стенку пробирки. В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда или пластинку стекла в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста другой микрофлоры (кроме вирусов) вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином. Размножение вируса в клетках определяют по цитопатическому действию (ЦПД): в результате размножения вируса в клетках при микроскопии обнаруживаются включения, дегенеративные изменения и в конечном итоге клетки гибнут. Так как рост клеток прекращается, рН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса). В связи с этим не изменяется и цвет среды. Питательной средой для культуры тканей могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкостей организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие). В настоящее время в вирусологической практике чаще всего применяют свежие культуры клеток (первичные или первично-трипсинизированные) и перевиваемые культуры (линии) клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из органов взрослых животных (чаще из почек обезьян и других животных) и эмбрионов человека, куриных фибробластов путём трипсинизации кусочков тканей с последующим культивированием клеток в питательной среде. С этой целью кусочки тканей измельчают ножницами (или другим способом), а затем промывают буферным раствором Хенкса для удаления клеток крови и обрабатывают 0,25-0,3% раствором трипсина. Трипсин разрушает межклеточные мостики и разъединяет клетки. С помощью камеры Горяева подсчитывают количество клеток, разводят до концентрации 400000 клеток в 1 мл. Полученную взвесь клеток разливают в пробирки, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 37⁰С в почти горизонтальном положении (под углом 5⁰) в специальных штативах. Через 3-4 дня на стенке пробирки образуется сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

Перевиваемые культуры клеток (растущие) – это стабильные линии клеток, пассируемые вне организма в течение многих лет. Их получают из злокачественных опухолей и из нормальных (эмбриональных) тканей человека и животных. К ним относятся: 1) линия Неlа - клетки карциномы шейки матки человека; 2) линия Нер-2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) линия Детройт-6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком лёгких; 4) линии А-0 и А-1 – клетки амниона человека; 5) линия СОЦ – клетки сердца обезьяны циномольгус и другие.

Полуперевиваемые или диплоидные культуры клеток – это клетки тканей человека, сохраняющие в процессе пассажей – до года – диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не подвергаются злокачественному перерождению и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Методы обнаружения вирусов в культуре ткани

Цитопатическое действие (ЦПД).

Реакция гемадсорбции.

Метод «цветных» проб.

Метод бляшек.

Иммунофлюоресцентный метод.

Реакция связывания комплемента.

Реакция гемагглютинации.

Реакция преципитации в агаре.

Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу.