Приготовление мазков и их фиксация

Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов:

1) приготовление мазков;

2) высушивание мазка;

3) фиксация мазка;

4. окраска мазка.

Для приготовления препарата, на обезжиренное предметное стекло, наносят каплю воды или физиологического раствора, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют тонким равномерным слоем по стеклу на площади приблизительно 1 см² . Если исследуемый материал находится в жидкой среде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем спиртовки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3-4 раза через пламя спиртовки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляются к поверхности стекла и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур.

При фиксации с помощью химических веществ используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон. Один из распространенных приемов фиксации - обработка препарата метиловым или этиловым спиртом, или смесью Никифорова (равные объемы этилового спирта и эфира). При этом препарат погружают на 5-20 мин. в фиксирующую жидкость.

Методы окраски мазков и красители, используемые в микробиологии.

Существуют простые и сложные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один из красителей, например, фуксин водный (1-2 мин.), метиленовый синий (3-5 мин.). При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. После истечения времени окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют излишки воды, высушивают на воздухе и микроскопируют.

При сложной окраске последовательно наносятся на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Таковы методы окраски по Грамму, по Цилю-Нильсену, окраска спор по методу Ожешки.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы, - основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители – в виде натриевых или калийных солей.

Красители основной природы

Красные Фиолетовые

нейтральный красный генциан фиолетовый

пиронин кристаллический фиолетовый

сафранин метиловый фиолетовый

фуксин метиловый зеленый

гематоксилин малахитовый зеленый

тионин

Синие Коричневые

Виктория везивин

метиленовый синий хризоидин.

Зеленые Черный

янус зеленый индулин

Красители кислой природы

Красные и розовые Черные Желтые

кислый фуксин нигрозин конго

эритрозин пикриновая кислота

флюоресцин

Интенсивность окрашивающей способности красителя завистит от рН среды: основные красители окрашивают объект тем интенсивнее, чем более щелочная среда, кислые – чем более кислая.

Красители можно разделить на: позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов. Они окрашивают клетки при комнатной температуре в течение 30-60 секунд. Негативные красители окрашивают пространство, окружающее клетки микроорганизмов. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

Простой метод окраски

На приготовленный и фиксированный мазок нанести несколько капель водного раствора фуксина. Окрашивать 1-2 мин. Смыть краску водой, промокнуть препарат фильтровальной бумагой, досушить на воздухе и микроскопировать.

Окраска по методу Грама.

1. На фиксированный мазок нанести карболово – спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1 –2 мин бумагу снять, а краситель слить.

2. Нанести раствор Люголя на 1 –2 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30 –60с до прекращения отхождения фиолетовых структур красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1- 2 мин., промыть водой, высушить фильторовальной бумагой и на воздухе, и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно – фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный.

Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшиеся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий пептидогликан многослоен, с ним связаны тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий пептидогликан однослоен, имеется наружная мембрана, в состав которой входят фосфолипиды, липопротеиды, белки и сложный мепополисахарид (ЛПС). Всю наружную мембрану пронизывают белки – порины, обеспечивающие диффузию различных соединений. Таким образом, у граммположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

К грамположительным бактериям относятся старилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и др., к грамотрицательным – гонококки, менингококки, кишечная палочка и др. Некоторые виды бактерии могут окрашиваться по Грамму вариабельно, в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки. Поэтому для окраски нужно брать всегда молодые, 1- суточные культуры.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Грамму, состоит в “переобесцвечивании” мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине–фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.