Методы культивирования вирусов

1. Культуры клеток.

2. Куриные эмбрионы.

3. Лабораторные животные.

Культуры клеток готовят из тканей животных или человека и разделяют их на:

1. первичные или неперевиваемые;

2. полуперевиваемые;

3. перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток состоит из этапов:

1. измельчение ткани;

2. разъединение клеток путем трипсинизации;

3. отмывание однородной суспензии изолированных клеток от трипсина;

4. суспендирование клеток в питательной среде, которая обеспечивает их рост;

5. перенос питательной среды и изолированных клеток ткани в специальные сосуды для культивирования.

Клетки начинают развиваться и в дальнейшем приклеиваются к стенкам сосуда, образуя слой на поверхности стекла. Такую культуру также называют однослойной культурой клеток.

После образования сплошного монослоя культура клеток может быть использована для дальнейшего пассирования. При повторном пересеве старую среду удаляют, клетки снимают со стекла трипсином, суспендируют в свежей питательной среде и рассевают в новые стерильные флаконы. Полученная таким образом культура носит название вторичная или полуперевиваемая культура клеток. С помощью специальных методик культивирования получают штаммы диплоидной культуры, клетки которой сохраняют диплоидный набор хромосом на протяжении 50-ти пассажей. Такая культура называется полуперевиваемой диплоидной или также полуперевиваемой. Непосредственно к такой культуре относятся диплоидные клетки человека.

Иногда, в процессе пассирования, диплоидная клетка может трансформироваться и дать начало линии клеток, обладающих гетроплоидным набором хромосом и способных к неограниченному размножению в культуре, - так появляются перевиваемые культуры. К перевиваемым культурам относятся злокачественные линии клеток человека и животных.

Развивающийся куриный эмбрион – наиболее простой и широко используемый объект для культивирования вирусов животных. Эмбрион используют на 10-12 день развития. В это время аллантоисная полость куриного эмбриона содержит 5-10мл жидкости. Наиболее простым способом внесения вируссодержащего материала является заражение в названную полость и будет более подробно рассмотрено ниже. Для разных вирусов иногда приемлемы другие пути заражения куриного эмбриона: в полость амниона, в хорион аллантоисную полость, желточный мешок.

Перед заражением, скорлупу яйца на воздушной камерой обрабатывают спиртом, обжигают на пламени, смазывают 2%-ным раствором йода, вторично протирают спиртом и обжигают. Границы воздушной камеры заранее обводят маркером при просвечивании. Над воздушной камерой в скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью ножниц, скальпеля или же специального буравчика.

Шприцем вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала в аллантоисную полость (на 2-3мм ниже точных границ воздушной камеры). Отверстие в скорлупе заливают парафином. Вскрытие эмбриона проводят через 48-72часа при инкубации 37 ⁰С. Сначала скорлупу, со стороны отверстия, протирают спиртом и 2%-ным раствором йода, - скорлупу рассекают ножницами, осторожно ее снимают, чтобы парафин и сама скорлупа не попали во внутрь. Снимают подскорлупную оболочку и рассматривают хориоаллантоисную оболочку вокруг места заражения, отмечая наличие или отсутствие очагов поражения. С помощью пастеровской пипетки прокалывают хорионаллантоисную оболочку в участке, свободном от сосудов, и отбираем аллантоисную жидкость. Извлеченную жидкость используют для проведения реакции ГА.

Хорионаллантоисную оболочку дважды промывают раствором хлориды натрия, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений.

К недостаткам этого способа культивирования вирусов относятся: невозможность обнаружения исследуемого вируса без вскрытия эмбриона, а также наличия в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторных животных для культивирования вирусов используют в тех случаях, когда вирус плохо репродуцируется в культуре клеток или в эмбрионе. Но заражение организма лабораторного животного: крысы, хомячки, морские свинки, кролики, мыши, посторонними вирусами ведет к уничтожению животного. И для получения чистой линии данного вируса все же необходимо использовать культуры клеток.

Методы индикации вирусов

Для индикации или обнаружения вирусов используют:

1. Цитопатическое действие вирусов (ЦПД).

2. Метод негативных колоний.

3. Реакция гемадсорбции (ГА).

4. Реакция гемагглютинации (РГА)

После получения монослоя жизнеспособных культур клеток их заражают материалом, который содержит вирусы. Цитопатическое действие (ЦПД) характеризуется морфологическими изменениями клеток. Часть из таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате, вместо сплошного монослоя клеток остаются лишь отдельные клеточные островки, которые обнаруживаются микроскопически. Характер ЦПД, вызваного разными вирусами неодинаков. Например, при поражении парамиксовирусами, герпесвирусами наблюдается слияние клеток с образованием синцития, при энтеровирусах, реовирусах – сморщивание и деструкция клеток, при аденовирусах – гроздевидная агрегация клеток, при поражении вирусом кори – симпластобразование. То есть, характер ЦПД используют для ориентировочной идентификации.

Определение вирусных частиц методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают 10-ти кратными разведениями вируса. После инкубации в 6-7 дней их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50% зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз

(ЦПД ₅₀) в 1 мл препарата.

ЦПД, кроме микроскопирования, может быть обнаружено методом негативных колоний или методом бляшек. Суть этого метода заключается в следующем: монослой клеток после удаления питательной среды заражают вируссодержащим материалом и покрывают слоем агара с индикатором нейтральным красным. Агар в этом случае используют для того, чтобы ограничить распространение вируса по клеточному слою. Инкубируют при 37 ⁰С и через 48-96 часов выявляют пятна бляшки или негативные колонии. Живые клетки накапливают краску, погибшие –ее теряют, поэтому участки клеточного монослоя, поврежденные вирусом, выглядят светлыми на фоне окрашенных клеток. Обычно бляшки имеют диаметр 1-3 мм. Пятна возникают за счет ЦПД вируса.

Наиболее точным количественным методом учета вирусных частиц является метод бляшек. Зависимость между числом образовавшихся бляшек и числом инфекционных вирусных частиц в препарате строго линейна, и, следовательно, каждая негативная колония соответствует одной инфекционной единице. Конечный результат титрования или титр вируса выражается количеством бляшкообразующих единиц –БОЕ.

Титр рассчитывают:

а

Титр вируса (БОЕ / мл) == --------------------------