Контрольные вопросы

1. Что называется культивированием?

2. Чистые и накопительные культуры.

3. Что называется инкубацией?

4. Методика приготовления почвенной суспензии.

5. Как проводится посев почвенных разведений на твердую среду.

6. Как проводится посев штрихом и посев уколом.

Рекомендованный материал

1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Н.С. МГУ, М. 1995. Стр. 122-124.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец.литература», С-Петербург. 1998. Стр. 107-110.

3. Медицинская микробиология. Гл. ред. Покровский В.И., Поздеев О.К. «ГЭОТАР Медицина». М., 1999. Стр. 996-1000.

4. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. «Медицина», М. 1983. Стр. 124-132.

5. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М. 1972. Стр.23-26.

Занятие 8

ТЕМА: Количественный учет микроорганизмов.

Вопросы для рассмотрения:

1. Подсчет клеток в счетных камерах.

2. Подсчет клеток в капиллярах Перфильева.

3. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида).

4. Подсчет клеток на мембранных фильтрах.

5. Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Кока).

6. Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений).

7. Определение биомассы взвешиванием.

8. Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом.

Задание для выполнения лабораторной работы.

1. Подсчитать клетки на фиксированных окрашенных мазках (по методу Виноградского-Брида). Вычислить количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл.

2. Сделать подсчет выросших колоний по чашечному методу Коха. Вычислить количество клеток в 1 мл воды (1л), почвенной суспензии, в 1м³ воздуха, в 1г воздушно-сухой почвы, в 1г абсолютно сухой почвы.

3. Подсчитать количество клеток микроорганизмов в 1 мл суспензии в камере Горяева.

Определение количества клеток микроорганизмов

1.Подсчет клеток в счетных камерах

а x 10³

М = ————— n

h x S

М — число клеток в 1мл суспензии

а — среднее число клеток в квадрате сетки

h — высота камеры в мм

S — площадь квадрата сетки в мм²

10³ — коэффициент перевода см³ в мм³

n — разведение исследуемой суспензии

2.Подсчет клеток в капиллярах Перфильева

a x 10³

М = ———————— n

h x L x d

М — число клеток в 1 мл исследуемого субстрата

а —- среднее число клеток в капилляре, длиной в диаметр поля зрения

h — высота капилляра в мм

L — ширина капилляра в мм

d —- диаметр поля зрения (длина капилляра ) при данном увеличении микроскопа, в мм

10³ — коэффициент перевода см³ в мм³

n — разведение исследуемого субстрата

4. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида)

a x S

М= —————— n

s x V

М — число клеток в 1 мл исследуемого субстрата

а — среднее число клеток в квадрате окулярной сетки

( поля зрения), мкм²

V — объем нанесенной на стекло суспензии в мл

S — площадь приготовленного мазка в мкм²

s --- площадь квадрата окулярной сетки поля зрения), мкм²

n — разведение исследуемого субстрата

4.Подсчет клеток на мембранных фильтрах

a x F x 10³

М = --------------------------- ,

V x s

М — количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата

а — среднее количество клеток в квадрате окулярной

сетки (поле зрения)

F — площадь мембранного фильтра в мм²

V — объем (мл) профильтрованной жидкости

10⁶ — коэффициент перевода мм² в мкм²

s — площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения)

5.Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)

а) подсчет клеток в водных образцах

а х 10ⁿ

М = ——————

V

М — количество клеток в 1 мл

а — среднее число колоний при высеве разведения

V — объем суспензии взятый для посева

10 ⁿ — коэффициент разведения

б) подсчет клеток, находящихся в воздухе

(b)100 x a

Х = —————- x 100 (c)

S

Х — число клеток микроорганизмов в 1 м³ воздуха

а — число колоний, выросших на чашках

S — площадь чашки Петри (S == Пr², 3,14 х 25 = 78,5 )

Установлено, что на 100 см² (b) падает примерно столько микробных зародышей, сколько их находится в 10л воздуха (0,01 см³ ), а чтобы узнать, сколько клеток находится в 1 м³ воздуха, то количество микробных зародышей умножают на 100 (с)

Общая обсемененность воздуха определяется по суммарному числу колоний, выросших на двух параллельных чашках:

менее 250 колоний — воздух чистый

250-500 колоний — загрязнен в средней степени

более 500 колоний — загрязнен

в) подсчет клеток микроорганизмов в почвенных образцах

а х 10ⁿ

М = ---------------------------- в 1 мл почвенной суспензии

V

М = а x 10ⁿ в 1 г сырой почвы

а х 10ⁿ

М = ————— в 1 г абсолютно сухой почвы

0,75

0,75 — при влажности почвы 25% 1 г сырой почвы содержит 0,75 г абсолютно сухой почвы

20 — коэффициент перевода 0,05 мл в 1 мл (0,05 х 20 = 1)

10ⁿ — разведение, взятое для посева

а — число колоний, выросших на чашках

V — объем суспензии, взятой для посева ( в мл)

Если используем глубинный посев, то расчет ведем по этой же формуле без коэффициента 20; если колонии выращены на бедных средах (нитратный агар, голодный агар), то определение количества микроорганизмов ведем в поле зрения микроскопа.

6. Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Используется таблица. Мак-Креди (наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии.

(Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Н.С. МГУ, М. 1995. Стр.126-127)