Занятие 18

ТЕМА: Вирусы гриппа. Вирусные гепатиты.

Вирус иммунодефицита человека.

Вопросы для рассмотрения.

1. Характеристика семейств: ортомиксовирусы, гепаднавирусы, ретровирусы.

2. Схема строения вириона вируса гриппа А.

3. Патогенезы заболевания гепатитами человека.

4. Схема строения вириона ВИЧ.

5. Механизм взаимодействия ВИЧ с клеткой

К семейству ортомиксовирусов относятся вирусы гриппа типов А, В, С. Вирусы типа гриппа А поражают человека и животных. Вирусы типа В и С патогенны только для человека. Отличаются вирусы А, В, С по нуклеопротеидным антигенам.

Вирус гриппа типа А

Вирион вируса гриппа А имеет сферическую форму. Геном представлен однонитевой фрагментированной негативной РНК. Тип симметрии нуклеокапсида спиральный. Вирион имеет суперкапсид, содержащий два гликопротеида: гемагглютинин и нейраминидазу, которые выступают над мембраной в виде различных шипов.

Адсорбция вируса на мембране клетки происходит благодаря взаимодействию его гемагглютинина с мукопептидом, в частности с N-ацетилнейраминовой кислотой. Затем вирус проникает в клетку с помощью одного из двух механизмов:

1. слияние мембраны вириона с мембраной клетки;

2. по пути окаймления ямки.

Второй этап раздевания вириона происходит на пути к ядру, так как необходимый вирусу участок, состоящий из метилированого гуанина и 10-13 прилегающих нуклеотидов, синтезируется в ядре.

Вирус гриппа типа очень чувствителен к нагреванию, высушиванию, действию солнечных, Уф свету, при комнатной температуре в с освещенном помещении гибнет через несколько часов.

Источником инфекции является человек. Заражение происходит воздушно-капельным путем. В связи с тем, что инкубационный период короток, 1-2 дня возникшая эпидемия очень бистро распространяется. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки дыхательных путей с преимущественной локализацией в области трахеи, что клинически проявляется сухим кашлем. Продукты распада пораженных клеток попадают в кровь, вызывают сильную интоксикацию и повышение температуры тела до 38-39 ⁰С.

Примерно каждые десять лет эпидемии гриппа принимают характер пандемий, охватывающих население разных континентов. Основным регулятором эпидемий гриппа является иммунитет. По мере нарастания иммунной прослойки к вирусу эпидемия гриппа идет на убыль. Но, вместе с тем, в результате формирования иммунитета происходит селективный отбор штаммов вирусов с измененной антигенной структурой, прежде всего гемагглютинина и, в меньшей степени, нейраминидазы, которые продолжают вызывать вспышки до тех пор, пока к ним не появятся антитела. Такой антигенный дрейф и поддерживает непрерывность эпидемий. Однако у вируса гриппа типа А обнаружена еще одна форма изменчивости, получившая название шифта, или сдвига, связанная с полной сменой одного типа гемагглютинина (реже нейраминидазы) на другой.

Материалом для исследований служит отделяемое носоглотки, кровь. Выявление вируса проводится путем заражения куриных эмбрионов, иногда культур клеток. Типовую принадлежность выделенного вируса определяют в РСК. Подтип гемагглютинина устанавливают В РЕГА, подтип нейраминидазы -- в реакции ингибирования нейраминадазной активнсоти.

Наиболее эффективная профилактика – вакцинация.

Вирус гриппа типа В

Структура вириона сходна со структурой вируса А. По антигенным свойствам гемагглютинина и нейраминидазы различают несколько серовариантов. Процесс антигенного дрейфа выражен слабее, чем у вируса А. Вирусы гриппа В являются виновниками локальных вспышек и эпидемий; пандемий не вызывают. Клиника заболевания, лабораторная диагностика, специфическая профилактика такая же, как при вирусе гриппа А.

Вирус гриппа типа С

Вирион имеет такую же форму, как вирусы типов А и В. Но геном представлен однонитевой негативной РНК их 7 фрагментов, а не 8-ми. У вируса типа С отсутствует нейраминидаза, поэтому на наружной мембране вириона имеется только один тип шипов; размерами не отличаются шипы всех типов вирусов. Вирус типа С распознается другими клеточными рецептором – мукопептидом, содержащим N-ацетил –9-О-ацетилнейраминовую кислоту. Это обстоятельство обуславливает отсутствие конкуренции на стадии адсорбции между вирусом типа С и вирусами других типов. В куриных эмбрионах культивирование проводят при пониженных температурах (32- 33 ⁰С). Клиника заболевания такая же, как при умеренных формах гриппа А. Диагностика основана на выделении в куриных эмбрионах, применяются также иммунофлуоресцентный метод и другие серологические реакции.

Вирусные гепатиты.

К вирусам, представители которых вызывают гепатит у человека, относятся по крайней мере 6 групп вирусов: вирусы гепатита А, вирусы гепатита В, дельта-вирус, вирус гепатита ни А ни В, вирусный гепатит Е, вирусный гепатит С.

Вирус гепатита А

Относится к семейству пикорнавирусов, роду энтеровирусов. Вызывает наиболее распространенный вирусный гепатит, который имеет несколько названий: инфекционный, эпидемический, болезнь Боткина, желтуха). Вирион гепатита А имеет сферическую форму. Геном представлен однонитевой позитивной РНК; суперкапсид отсутствует; тип симметрии – кубический.

Вирус обладает пониженной способностью к репродукции в культурах клеток. Устойчив к высоким температурам, кислотам, жирорастворителям, дезинфицирующим средствам, хорошо переносит низкие температуры, высоко резистентен к хлору, благодаря чему способен проникать в водопроводную воду через барьеры водоочистных сооружений.

В отличие от других энтеровирусов, вирус гепатита типа А репродуцируется в летках печени. Заболевание заканчивается полным выздоровлением, летальные исходы очень редки. При перенесении инфекции формируется пожизненный гуморальный иммунитет. Лаборатоная диагностика проводится путем выявления вируса в фекалиях больного методом иммуноэлектронной микроскопии. Специфической профилактики нет. Для пассивной иммунопрофилактики гепатита А используют иммуноглобулин, полученный из смеси донорских сывороток.

Вирус гепатита типа В.

Эта форма гепатита является наиболее опасной по своим последствиям среди всех известных форм вирусных гепатитов. Относится к семейству гепаднавирусов.

Вирионы или частицы Дейна имеют сферическую форму. Суперкапсид вириона состоит из трех белков: главного или основного, большого и среднего. Геном заключен в капсид и представлен двунитевой кольцевой ДНК. Синтез вирусных белков жестко контролируется на уровне транскрипции и трансляции. Вирус гепатита В не репродуцируется в культурах клеток и куриных эмбрионах. Репликация и трансляция вирусного генома происходит в ядрах гепатоцитов.

Поскольку входными воротами инфекции при гепатите В являются кровеносные сосуды, вирус сразу же попадает в кровь и разносится по всему организму, фиксируясь, прежде всего, на гепатоцитах. Но патологический процесс в печени возникает не с момента внедрения возбудителя в гепатоциты, а только после распознавания иммуноцитами его антигенов на наружной мембране этих клеток.

Источником инфекции являются больные люди и вирусоносители. Заражение вирусом гепатита В часто происходит при медицинских манипуляциях в результате попадания хотя бы следов инфицированной крови в организм здорового человека. Это имеет место при переливании донорской крови, использовании недостаточно простерилизованных шприцев и других медицинских инструментов, взятии крови на анализ, массовых прививках. Доказана передача возбудителя при половом контакте. Кроме того, может произойти трансплацентарное заражение плода, а также новорожденных при прохождении через инфицированные родовые пути матери.

Вирус гепатита В очень устойчив к высоким температурам, к кислым средам, но разрушается в щелочной среде. Вирус погибает при обработке перекисью водорода, хлорамином, формалином, фенолом, Уф облучении.

Выявляют вирус иммуноферментным или радиоиммунным методами. Прививки против гепатита В в объязательном порядке проводятся на первом году жизни.

Другие возбудители вирусных гепатитов.

Геном дельа-вируса представлен однонитевой молекулой РНК. Для репродукции данного вируса необходимо участие вируса «помощника», роль которого играет вирус гепатита типа В. Специфическая профилактика не разработана. В настоящее время классификации к определенному семейству не поддается.

К вирусам гепатита ни А ни В относится ряд вирусов, являющихся возбудителями таких форм вирусных гепатитов, которые по своим клиническим и эпидемилогическим особенностям отличаются от гепатитов А, В, а также гепатита, вызываемого дельта-вирусом.

Возбудитель гепатита С по ряду биохимических свойств имеет некоторое сходство с флавивирусами. Генетический материал представлен нефрагментированной позитивной РНК. Источником инфекции является человек. Распространение вируса происходит трансфузионно при переливании крови и ее препаратов или инструментальным путем. Поддержанию эпидемического процесса способствует склонность гепатита С к хроническому течению. Клиническая картина сходна с таковой при гепатите В, однако заболевание протекает легче и характеризуется относительно быстрым выздоровлением. Наряду с вирусом гепатита В, вирус гепатита С, благодаря хроническим поражениям печени, является одной из главных причин рака печени. Серодиагностика основывается на выявлении антител в сыворотке крови.

Возбудитель гепатита Е имеет некоторое сходство с калицивирусами. Геном представлен РНК. Поражает печень. Источником инфекции является только инфицированный человек, который выделяет возбудитель с испражнениями. Механизм заражения – фекально-оральный. Основной путь передачи – водный, что обусловлено тем, что вирус способен, фильтруясь через верхние слои почвы, проникать в грунтовые воды и инфицировать их. Диагноз острого гепатита Е ставят методом исключения гепатитов А, В, С. Используют метод иммунной электронной микроскопии

Особенности семейства ретровирусов.

1. Геном представлен двумя идентичными копиями однонитевой РНК. Ретровирусы – единственное семейство вирусов с диплоидным геномом.

2. Наличие фермента обратная транскриптаза, которая способна переписывать информацию с РНК на ДНК. Такой процесс назван обратной транскрипцией. РНК - геном превращается в ДНК –геном и в таком виде интегрируется в хромосому клетки-хозяина, в результате чего она либо погибает (ВИЧ), либо превращается в опухолевую. (онковирусы).

3. Функция обратной транскриптазы не поддается контролю, поэтому фермент допускает много ошибок, что влечет за собой высокую частоту мутаций структурных белков вируса, то есть, постоянную изменчивость. А это, в свою очередь, создает трудности в создании эффективных вакцин.

Семейство ретровирусов подразделяется на три подсемейства:

1. Spumavirinae - спумавирусы, “пенящиеся” вирусы. При размножении в культуре клеток происходит интенсивное симпластобразование, которое придает культуре вспененный вид. Патогенность не установлена, но выделяют в том числе и из организма человека.

2. Oncoovirinaе – онкогеннве вирусы, в т.ч. вирусы, ответственные за превращение нормальной клетки в опухолевую.

3. Lentivirinae – лентивирусы, вирусы, которые являются возбудителями медленных инфекций человека. Сюда относится ВИЧ.

Схема строения вириона ВИЧ.

Вирионы имеют сферическую форму 100-120 нм в диаметре. Внешняя оболочка вирионов образована двойным липидным слоем с расположенными на нем гликопротеиновыми шипами. Каждый шип состоит из двух субъединиц, первая из которых пронизывает липидный слой, вторая находится снаружи. Под внешней оболочкой расположена сердцевина вириона цилиндрической или конусовидной формы. В сердцевине заключены РНК, обратная транскриптаза и внутренние белки.

Механизм взаимодействия ВИЧ с клеткой

Проникнув в организм, вирус в первую очередь атакует клетки, содержащие специфический для него рецептор СD4. Этот рецептор имеют в большом количестве Т-хелперы, а в меньшем – макрофаги и моноциты.

Вирус распознает СD4- рецепторы с помощью своего белка gp120. Процесс взаимодействия ВИЧ с клеткой протекает по следующей схеме: рецепторопосредованная адсорбция – окаймленная ямка -- окаймленный пузырек – лизосома. В ней мембрана вириона сливается с мембраной лизосомы, и нуклеокапсид, освобожденный от суперкапсида, выходит в цитоплазму; на пути к ядру он разрушается, и высвобождается геномная РНК и ассоциированные с ней компоненты сердцевины. Далее обратная транскриптаза синтезирует на вирионной РНК минус цепь ДНК, затем РНК-азы Н разрушает вирионную РНК, а вирусная ДНК-полимераза синтезирует плюс-цепь ДНК. Так образуется ДНК-провирус, который может находиться в ядре некоторое время в неактивной форме, но рано или поздно он с помощью своей интегразы встраивается в хромосому клетки-мишени. В ней провирус находится в неактивном состоянии до тех пор, пока данный Т-лимфоцит не будет активирован микробными антигенами или другими иммунокомпетентными клетками. Активация транскрипции клеточной ДНК регулируется особым ядерным фактором (NF-кВ). Он является ДНК-связывающим белком и вырабатывается в большом количестве при активации и пролиферации Т-лимфоцитов и моноцитов. Этот белок связывается с определенными последовательностями клеточной ДНК и сходными последовательностями LTR ДНК -провируса и индуцирует транскрипцию, как клеточной ДНК, так и ДНК-провируса. Индуцируя трансукипцию ДНК-провируса, он и осуществляет переход вируса из неактивного состояния в активное и, соответственно, персистентной инфекции – в продуктивную. Пребывание провируса в неактивном состоянии может продолжаться очень долго. Активация вируса является критическим моментом в его взаимодействии с клеткой. С момента инфицирования вирусом клетки начинается период вирусоносительства, который может продолжаться до 10 лет и более. С момента активации вируса начинается сама болезнь – ВИЧ-инфекция. С помощью своих регуляторных генов и их продуктов вирус начинает активно размножаться. ТАТ-белок может повысить скорость репродукции вируса в 1000 раз. Транскрипция вируса носит сложный характер, которая включает образование как полноразмерных, так и субгеномных мРНК, сплайсинг мРНК, а далее происходит синтез структурных и регуляторных белков. Суперкапсидные белки синтезируются на мембранных рибосомах, подвергаются гликозилированию и транспортируются к клеточной мембране. Белок gp41 устанавливается внутри мембраны, а gp120 – на ее наружной поверхности.

Заключительная стадия морфогенеза вириона происходит на клеточной мембране. Вирусные частицы формируются из трех различных белков: gp120, расположенного на наружной поверхности клеточной мембраны; связанного с ним трансмембранного белка gp41 и белка предшественника нуклеокапсидных белков, кодируемых генами gag-pol. Этот белок представлен полипептидами разной длины. Короткий предшественник втягивает в образующийся нуклеокапсид две молекулы вирионной РНК. От длинного белка-предшественника отрезается протеаза, которая и запускает процесс образования нуклеокапсида. Она отрезает от длинного предшественника еще одну молекулу протеазы, молекулу полимеразного комплекса и молекулу интегразы. После этого протеаза разрезает каждый из белков- предшественников на 4 части: р17, р24, р7, р9. Такое нарезание белка-предшественника происходит в цитоплазме клетки. Белки р7 и р9 связываются с двумя молекулами вирионной РНК, белками- ферментами (протеаза, полимеразный комплекс, интеграза) и одной молекулой затравочной тРНК^лиз и образуют нуклеокапсид. Белок р24 покрывает нуклеокапсид и придает сердцевине вириона структуру дельта-икосаэдра. Белок р17 является N-концевым полипептидом белка-предшественника. Одна из сигнальных последовательностей N-конца белка р17 обуславливает его заякоривание в липопротеидной мембране. Белок р17 вначале, по-видимому, поступает в ядро и обеспечивает оттуда транспорт нуклеокапсида к клеточной мембране, где происходит сборка вируса. Белок р17 окружает сердцевину вириона, способствуя сохранению его икосаэдрической симметрии. Проходя через клеточную мембрану, сердцевина вириона покрывается ее двойным липидным слоем, содержащим белки gp41 и gp120; зрелый вирион покидает зараженную клетку и повторяет свой цикл развития.

Вирус иммунодефицита обладает высокой изменчивостью. Даже из организма одного больного могут быть выделены штаммы вируса, существенно отличающиеся друг от друга по антигенным свойствам,… но никакой серологической классификации ВИЧ-1 нет.

Причины иммунодефицита. Одной из основных причин иммунодефицита при ВИЧ-инфекции является массовая гибель Т-хелперов. Она наступает вследствие следующих этапов: при выходе большого количества вновь синтезированных вирионов у Т-хелперов разрушается мембрана, и они гибнут. Т-киллеры распознают и разрушают Т-клетки, инфицированные вирусом или несущие на себе адсорбированные молекулы gp 120, а также вирусинфицированные и не зараженные вирусом Т-хелперы, которые образуют симпласты или синцитии. То есть происходит подавление активности систем комплемента и макрофагов. Инфицированные вирусом макрофаги и моноциты долго не гибнут, но не способны удалять вирус из организма.

Следствием ВИЧ-инфекции является поражение всех основных звеньев системы иммунитета. Такие больные становятся беззащитными против самых различных микроорганизмов. ВИЧ обладает не только лимфоцито- , но и нейротропностью. Он проникает в клетки ЦНС (астроциты) как путем рецепторопосредованного эндоцитоза, так и при фагоцитозе астроцитами вирусинфицированных лимфобластов. При взаимодействии вируса с астроцитами также служат резервуаром и распространителями его в организме, будучи способны проникать во все ткани. Инфицированным макрофагам принадлежит главная роль в заносе ВИЧ в ЦНС и проявляются в виде деменции (слабоумия).

Основным методом диагностики вирусоносительства и ВИЧ-инфекции является иммуноферментативный метод. Для этой цели существуют различные тест-системы, с помощью которых обнаруживают антитела к ВИЧ. Однако в связи с тем, что gp120 имеет структурное и антигенное сходство с рецепторами некоторых клеток человека, в том числе с рецепторами, которые осуществляют транспорт иммуноглобулинов через эпителиальные клетки слизистых оболочек, в организме могут появляться антитела, родственные антителам против gp120. В этом случае могут быть ложнопозитивные результаты ИФМ. Поэтому все положительно реагирующие сыворотки исследуемых, подвергаются дополнительному анализу с помощью метода иммуноблотинга или вестернблотинга. В основе этого метода лежит идентификация исследуемых антител после электрофоретического разделения их и последующего тестирования с помощью меченых антивидовых антител. Клон лимфоцитов Н9 используется для получения вирусных антигенов - необходимых компонентов диагностических тест-систем.

Многочисленные попытки получить эффективные лечебные препараты пока оказались безуспешными. Как уже оговаривалось выше (характеристика семейства ретровирусов), задача заключается в том, чтобы найти такой препарат ил вакцину, которые прежде всего подавляли активность обратной транскриптазы, что исключает возможность образования ДНК-провируса и интеграцию его в хромосому клетки. Ведется также поиск препаратов, которые бы избирательно угнетают какую-либо стадию репродукции вируса. Пока единственным препаратом, который позволяет задержать на какое-время развитие ВИЧ-инфекции, является азидотимидин (ретровир). Этот препарат является аналогом нуклеотида тимидина, который включается в растущую цепь ДНК провируса и блокирует ее дальнейший синтез. Лечение азидотимидином продлевает жизнь больным ВИЧ-инфекцией на 1,5-2 года, но к этому препарату у ВИЧ-1 и ВИЧ-2 вырабатывается резистентность.