Контрольные вопросы.

1. Какие микроорганизмы относятся к аэробам, анаэробам (облигатным, факультативным), микроаэрофилам?

2. Микроорганизмы по отношению к температуре: психрофилы (облигатные, факультативные), мефозилы, термофилы (термотолератные, факультативные, облигатные, экстремальные).

3. Значение активной кислотности среды для микроорганизмов.

4. Значение света и воды для культивирования микроорганизмов. Активность воды.

5. При каких условиях и как культивируются аэробные микроорганизмы?

6. Особенности культивирования анаэробных микроорганизмов. Способы культивирования.

7. Что такое периодическое и непрерывное культивирование?

8. Способы хранения микроорганизмов, их суть.

Рекомендованный материал

1. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. МГУ, М. 1985. Стр. 94-108.

2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Егоров Н.С. МГУ, М. 1995. Стр. 18-19, 56-70.

Занятие 10

ТЕМА: Определение состава клеток микроорганизмов.

Вопросы для рассмотрения.

1. Методы разрушения клеток.

2. Определение белков.

3. Анализ нуклеиновых кислот.

4. Выделение и анализ полисахаридов.

5. Изучение состава клеточных стенок микроорганизмов.

Задание для выполнения лабораторной работы.

1. Разрушить клетки микроорганизмов одним из методов

I.Методы разрушения клеток микроорганизмов.

1. Гомогенизация — для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой, не имеющих клеточной стенки, для растительных и животных клеток.

Делается суспензия клеток в буферном растворе. Контролируют степень разрушения в фазово-контрастном микроскопе или по белку, освобожденному из клеток.

2. Растирание клеток с абразивами.

В качестве абразивов используется кварцевый песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия. Также используется растирание замороженных клеток в жидком азоте, где абразивом выступают кристаллы льда. После растирания к полученной массе добавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, не разрушенных клеток и их обломков.

3. Разрушение со стеклянными бусами.

Растирают микроорганизмы с прочной клеточной стенкой — дрожжи. Метод основан на механическом растирании клеток, попадающих между двумя мелкими стеклянными шариками. На 1 г клеточной массы добавляют 1-3 г отмытых охлажденных шариков.

4. Обработка ультразвуком

При этом разрушении происходит механический разрыв клеток за счет вибрации. Необходим строгий контроль за нагревом излучателя и температурой материала. Излучатель охлаждают холодной проточной водой, а пробу — в воде со льдом. Для усиления эффекта используют абразивы. Полноту разрушения контролируют микроскопически. Актиномицеты , грибы и дрожжи разрушаются с трудом.

5. Френч-пресс.

Основан на перепаде давления от высокого (1550-1400) к низкому (атмосферному). Перепад давления взрывает клетки изнутри. Контролируют полноту разрушения микроскопически или по увеличению вязкости жидкости ( в результате выхода ДНК ).

6. Х - пресс.

Используют замороженные клетки в буферном растворе при -70 С.

Затем продавливают через тонкую фильеру с помощью гидравлической системы. Клетки разрушаются от перепадов давления от атмосферного до высокого.

7. Лизис клеток с применением ферментов.

Добавляют буферный раствор и фермент к небольшой биомассе и таким образом получают сферопласты и пропопласты.

8. Лизис клеток с помощью детергентов.

Клетки промывают несколько раз буферным солевым раствором и добавляют детергент ( тритон Х-100), инкубируют на льду.

9. Лизис клеток в присутствии органических растворителей.

Используют невысокую концентрацию (0,1-1,0%) толуола. Применяют для микроорганизмов, осажденных на фильтрах.

10. Лизис осмотическим шоком.

Используют высокую концентрацию солей или углеводов. Далее разводят дистиллированной водой в 10-50 раз. Используют для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой или при ее отсутствии.

11. Лизис с помощью замораживания-оттаивания.

Замораживают с жидким азотом, оттаивают в теплой воде. Позволяет обрабатывать большое количество биомассы.

Определение состава клеток микроорганизмов.

1. Определение белка.

1. Измерение поглощения при 280 нм.

Этот метод основан на поглощении тирозиновых, фенилаланиновых и триптофановых остатков; нуклеиновые кислоты могут вносить значительный вклад в адробцию, если присутсвуют в пробе, так как максимум поглощения при 260 нм. Если образец сильно загрязнен нуклеиновыми кислотами, то вноситься поправка. Используют кварцевые кюветы, так как стеклянные и пластиковые кюветы поглощают ультрафиолетовый свет.

2. Определение белка по Бредфорду.

Метод основан на количественном связывании белков с красителям, который реагирует с очищенными белками. В пробу добавляют рабочий раствор красителя и определяют оптическую плотность раствора при 595 нм.

3. Определение белка по Лоури.

Определение ведется при длине волны 750 нм. Это наиболее точный метод определение беков, но присутствует отрицательное влияние многих соединений, но это может быть преодолено осаждением белка перед определением, для чего применяется ТХУ (трихлоруксусная кислота) и дезоксалат натрия: добавляют реактивы, выдерживают 20-30 мин и измеряют оптическую плотность.

2. Определение нуклеиновых кислот.

Включает этапы:

1. выделение ДНК — разрушение клеток;

2. очистка ДНК (от белков) используют смеси хлороформ - изоамиловый спирт или фенол-хлороформ; переосаждение этанолом. От следов белка избавляются с помощью протеаз, от РНК — РНКазы. Ели необходимо сохранять, ДНК сушат под вакуумом и хранят при 4 ⁰С;

3. определение нуклеотидного состава ДНК.

Определение нуклеотидного состава ДНК.

1. Метод тепловой денатурации основан на разрушении водородных связей между комплементарными цепями ДНК и их расхождение при повышении температуры раствора ДНК.

2.Метод определения состава ДНК по плавучей плотности. Если раствор ДНК подвергнуть высокоскоросотному центрифугированию в градиенте плотности СsCl, то через определенное время она займет в градиенте место, соответствующее своей плавучей плотности.

2. Определение поли-β-оксимасляной кислоты (ПБОМК).

Для экстракции ПБОМК из клеток биомассу после охлаждения высушивают смесью диэтилового эфира и метанола. ПБОМК экстрагируют из навески биомассы смесью хлороформа и метанола при 60 ⁰С в течение 20 минут Экстракт упаривают досуха под вакуумом. Осадок растворяют в 1н серной кислоте и измеряют оптическую плотность при 235 .

2. Выделение и анализ полисахаридов.

Из культуральной жидкости полисахариды выделяют осаждением 5 объемами этанола или изопропанола. Осадок, который образуется за 24 часа при комнатной температуре, отделяют центрифугированием и сушат его на воздухе.

Количество редуцирующих сахаров в гидролизате полисахарида определяют по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ). Качественный моносахаридный состав полисахарида определяют методом тонкослойной хроматографии.

2. Анализ состава клеточных стенок микроорганизмов.

У большинства бактерий главным полимером клеточной стенки является пептидогликан.

1. Выделение и очистка фракций клеточных стенок.

Клетки грамположительных бактерий механически разрушают, центрифугируют и наблюдают два слоя: нижний - неразрушенные клетки и верхний клеточные стенки студенистой консистенции. Верхний слой отдельно промывают водой, лиофилизируют. Высушенную массу стенок бактерий экстрагируют трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Смесь и осадок стенок отмывают водой при центрифугировании до нейтральной кислотности. Осадок суспендируют в буферном растворе и обрабатывают трипсином в течение 20 минут. Далее осадок промывают буфером, 2%-ным дезоксихолатом натрия. Отмывают 1 н хлоридом натрия, дистиллированной водой. Высушивают спиртом или эфиром и досушивают в вакуум-эксикаторе.

2. Анализ состава пептидогликана (ПГ).

Выделенный и очищенный ПГ помещают в ампулу, добавляют 4 н соляную кислоту и инкубируют 16 часов при 100 ⁰С. Анализ гидролизата проводят на аминокислотном анализаторе, после чего вычисляют мольное отношение аминокислот, мурамовой кислоты и глюкозамина. В том случае, если обнаруживается диаминопимелиновая кислота, то определяют ее стереоизомер.