5 курс / Пульмонология и фтизиатрия / ЗАБОЛЕВАНИЯ_ОРГАНОВ_ДЫХАНИЯ_В_ДЕТСКОМ_ВОЗРАСТЕ

содержание белка более 2-3%;

положительная реакция Ривальта (помутнение жидкости при добавлении слабого раствора уксусной кислоты);

наличие нейтрофилов при острых инфекциях, лимфоцитов при туберкулезе; их число обычно превышает 2000 в 1 мм3.

Транссудат (невоспалительный), его характерные признаки:

содержание белка менее 30 г/л;

число лейкоцитов менее 2000 в 1 мм3;

преобладают мононуклеары.

Экссудат при плевритах может быть серозным, серознофибринозным, фибринозным, гнойным или геморрагическим. При фибринозном плеврите экссудат густой и его трудно извлечь из плевральной полости.

Пункция легкого с аспирацией – самый надежный метод этиологической диагностики процесса, выполняется иглой (для внутримышечных инъекций) со шприцем объемом 10 мл, содержащим 0,5-1 мл стерильного физраствора. Кожу обрабатывают раствором йода и спиртом. Иглу быстро вводят на глубину 3-5 см, вводят физраствор и тотчас же поршень шприца потягивают назад и иглу выводят. Каплю аспирата помещают на стекло для микроскопии, а иглу со шприцем заполняют питательной средой.

Осложнение – пневмоторакс наблюдается в 5-10%, манипуляцию проводят в случаях тяжелой, рефрактерной пневмонии, особенно у лиц с иммунодефицитом.

Биопсия легкого проводится для расшифровки природы диффузных, в основном, интерстициальных процессов, когда другие методы (в т.ч. биопсия слизистой бронха, щеточная биопсия или катетер-биопсию по Фриделю) не дали четкого ответа.

Пункционная биопсия специальными иглами дает скудную информацию, часто осложняется пневмотораксом или кровотечением, у детей ее не рекомендуют. Открытая биопсия выполняется как клиновидная резекция доли, она более информативна.

Торакоскопия – осмотр полости плевры через торакоскоп, используется редко, в основном во фтизиатрической и онкологической практике. Через торакоскоп проводят биопсию плевры, разделение спаек.

21

Иммунологические методы исследования

Взащитных реакциях участвуют как гуморальные, так и клеточные факторы.

Всилу особенностей онтогенеза неспецифические факторы защиты у детей имеют большее значение, чем у взрослых.

Острофазный ответ представляет собой закономерную адаптационную реакцию на метаболические и физиологические изменения при воспалении. В течение острой фазы воспаления – как инфекционного, так и неинфекционного – может значительно меняться содержание некоторых белков в биологических жидкостях, так называемых белков острой фазы воспаления, которые относятся к разным группам. В настоящее время таких белков насчитывается более тридцати. Указанные белки синтезируются гепатоцитами, лимфоцитами, нейтрофилами, моноцитами, фибробластами, глиальными и опухолевыми клетками.

Врегуляции синтеза острофазных белков участвуют интерлейкины, ФНО, факторы роста, глюкокортикоиды и половые гормоны. В зависимости от динамики концентрации в крови в определенные промежутки времени после начала воспалительного процесса белки острой фазы воспаления подразделяют на несколько групп:

главные белки – их концентрация увеличивается в 1001000 раз в течение 6-12 ч (СРБ, сывороточный амилоид А (содержание в норме 0,4 мг/л) и др.);

белки, концентрация которых повышается в 2-5 раз в течение 24 ч (орозомукоид, гаптоглобулин и др.);

белки, концентрация которых повышается на 20-60% в течение 48 ч (компоненты системы комплемента, пропердин и др.);

нейтральные белки острой фазы – их концентрация не изменяется (альфа-2-макроглобулин и др.);

негативные белки острой фазы, концентрация которых падает в течение 12-48 ч (альбумин, трансферрин и др.).

Для оценки состояния неспецифической защиты чаще всего определяют содержание СРБ, орозомукоида, трансферрина и пропердина, а также активность лизоцима.

Основные методы определения факторов неспецифической

22

защиты: радиальная иммунодиффузия по Манчини (в последнее время она используется всё реже) и иммуноферментный анализ (ИФА). Весьма перспективны для клинического использования современные автоматизированные высокопроизводительные системы анализа гуморальных факторов с двойной системой детекции:

1)кинетическая нефелометрия, обеспечивающая высокую точность и воспроизводимость;

2)иммуноферментный анализ в инфракрасном диапазоне с добавлением микролатексных частиц.

Повышение уровня СРБ считается универсальным маркером острой фазы воспаления. Определение СРБ в клинической практике имеет много преимуществ – многократное (в 100-1000 раз) увеличение концентрации в начале воспалительного процесса, отсутствие изменений при вирусной инфекции, быстрое снижение концентрации СРБ до нормы при стихании воспаления и, наконец, простота определения.

Орозомукоид выполняет транспортную и иммуномодулирующую функции, участвует в регуляции воспаления и митотической активности клеток. Повышение уровня орозомукоида в крови служит маркером бактериальной инфекции.

Трансферрин участвует в регуляции иммунного ответа, в частности стимулирует функции естественных киллерных клеток, способствуя тем самым подавлению вирусной инфекции.

Значительная роль пропердина как неспецифического фактора защиты заключается в активации комплемента по альтернативному пути. Содержание этого белка при рождении очень низкое, но уже в первые дни жизни резко возрастает и достигает уровня, свойственного взрослым, к 7 годам.

Лизоцим сыворотки представляет собой белок гранул нейтрофилов, работающий как муколитический фермент, что обусловливает его бактерицидные свойства. У новорожденных активность лизоцима сыворотки значительно выше, чем у взрослых. С возрастом его активность отчетливо снижается.

Уровень неспецифической защиты характеризует остроту, течение и длительность воспалительного процесса в бронхолегочной системе (равно как и в других органах). В остром периоде эти показатели выше, чем в периоде репарации, а

23

при затяжном течении могут существенно снижаться, вероятно, вследствие истощения.

В диагностике и дифференциальной диагностике хронических бронхолегочных заболеваний большую роль играет исследование специфических механизмов иммунной реактивности.

Как известно, материальную основу приобретенного специфического иммунитета составляют Т- и В-лимфоциты. Гуморальный специфический иммунитет реализуется В-лимфоцитами и синтезируемыми ими иммуноглобулинами. Клеточный специфический иммунитет представлен популяцией Т-лимфоцитов, среди которых выделяют хелперы и цитотоксические клетки с супрессорными свойствами. Нормальный иммунный ответ обеспечивается совместным функционированием Т- и В-лимфоцитов. При этом с помощью Т- лимфоцитов реализуются клеточные реакции гиперчувствительности замедленного типа. В-лимфоциты в кооперации с Т-лимфоцитами трансформируются в плазматические клетки и осуществляют синтез специфических антител (иммуноглобулинов).

Для суждения о функциональном состоянии В-лимфоцитов определяют уровни иммуноглобулинов в крови и других биологических жидкостях. Оценка уровней иммуноглобулинов позволяет выявить иммунодефицит, на фоне которого могут развиваться бронхолегочные заболевания.

Для правильной интерпретации результатов определения уровней иммуноглобулинов в крови и других биологических жидкостях помимо возрастных норм следует учитывать возможность значительных индивидуальных колебаний.

Учитывая многообразие инфекционных агентов (бактерии и вирусы, внеклеточные и внутриклеточные микроорганизмы), участвующих в развитии хронического воспаления в легких и бронхах, и активацию различных иммунных реакций, необходимо выявлять причинно-значимые антигены (инфекции) и определять титры специфических антител классов A, G, М к этим антителам.

При исследовании специфического гуморального иммунитета очень важно изучить распределение антител по различным классам иммуноглобулинов. Например, наличие в

24

крови и других биологических жидкостях антител класса IgM к какому-либо антигену указывает на то, что инфицирование произошло недавно, в то время как присутствие антител класса IgG свидетельствует о более давнем инфицировании.

Для определения причинно-значимых антигенов и титров специфических антител используют ИФА, иммуноблоттинг, ДНК- и PHК-диагностику (полимеразную цепную реакцию), экспресс-диагностику посредством микрочипов.

При исследовании клеточного звена иммунитета также могут быть выявлены нарушения, которые создают основу для развития хронического воспаления в бронхолегочной системе. Многообразие функций Т-лимфоцитов обеспечивается существованием различных субпопуляций этих клеток, «запрограммированных» на реализацию тех или иных задач.

Открытие и широкое внедрение системы Human Leukocyte Differentiation Antigens, или, как ее чаще называют в лабораторной практике, системы CD маркеров, позволило дифференцировать клеточные популяции и определять функциональное состояние клеток на основании исследования экспрессии поверхностных антигенов. В-лимфоциты дифференцируют по маркеру CD19; общие Т-лимфоциты – по CD3; Т-лимфоциты хелперы/индукторы – по CD4; Т-лимфоциты киллеры/супресcоры – по CD8 и т.д. Основные иммунологические исследования, которые необходимы при диагностике хронических заболеваний бронхолегочной системы приведены в таблице 1.

Таблица 1. – Основные иммунологические исследования при хронических заболеваниях бронхолегочной системы

25

Примечание: ИЛ – интерлейкин; ТН1 – Т-хелперы 1-го типа; ТН2 – Т-хелперы 2-го типа.

26

Аллергологические исследования

Выполняют следующие пробы:

кожные (аппликационные, скарификационные);

внутрикожные;

провокационные пробы с аллергенами.

При скарификационных пробах после предварительной обработки спиртом на кожу предплечья или спины наносят капли различных аллергенов, сквозь которые скарификатором делают насечки. Кожно-аллергическая реакция учитывается спустя 20 минут от момента введения аллергена.

В сыворотке крови определяют общий IgE и специфические

IgE и IgG.

Методика проведения потовой пробы методом пилокарпинового ионофореза и определение концентрации электролитов в поте (классический метод Гиббсона-Кука, 1959)

Аппаратура, материалы и реактивы:

аналитические весы;

гальванический аппарат для постоянного тока до 50 мА;

2 набора свинцовых пластинчатых электродов толщиной 0,2-0,4 мм с размером анода 6,5x8,5 см для детей старше 3 лет и 4,0x5,5 см для детей первых трех лет жизни; размер катода должен быть на 0,5 см длиннее и шире анода;

набор гидрофильных прокладок к электродам толщиной не менее 1 см и на 1 см длиннее и шире свинцовых электродов;

бинты резиновые или эластичные;

полиэтиленовая пленка;

ватно-марлевые подушечки;

лейкопластырь;

пинцеты;

бюксы на 20 мл;

фильтровальная бумага;

беззольные фильтры;

0,07% раствор хлористоводородного пилокарпина;

0,01 N pаствор AgNO3;

дважды перекристаллизованный МаС1;

27

10% водный раствор хромата калия;

спирт 50°.

Методика пилокарпинового ионофореза

Кожа внутренней поверхности верхней трети предплечья последовательно очищается спиртом и водой. На обработанное место кладется смоченный 0,07% раствором пилокарпина кусок фильтровальной бумаги размером с прокладку. Сверху накладывается смоченная теплой водой прокладка и анод, которые покрываются полиэтиленовой пленкой и укрепляются эластичным бинтом. Катод аналогичным образом фиксируется на наружной поверхности плеча без обработки кожи.

Включается гальванический аппарат и сила тока постепенно доводится до 1,5-2 мА для малых электродов и 4-6 мА – для больших. Продолжительность процедуры не более 10 минут. Затем ток постепенно снижается до 0 и аппарат выключается. Электроды снимаются, покрасневший участок кожи под анодом промывается дистиллированной водой и высушивается. После этого на него накладывается листок предварительно взвешенного в бюксе беззольного фильтра размером 4x6 см, сверху покрывается полиэтиленовой пленкой, на 1 см выходящей за края бумаги. Пленка тщательно приклеивается к коже лейкопластырем, чтобы избежать испарения потовой жидкости. Сверху накладывается ватно-марлевая подушечка и укрепляется бинтом.

Продолжительность собирания пота – 30 минут. При плохом потоотделении время увеличивается до 60 минут. Затем пленка снимается, листок беззольного фильтра быстро переносится пинцетом (не руками!) в бюкс и вновь взвешивается. Разница в показателях второго и первого взвешивания соответствует количеству выделенного пота. С помощью этой методики можно получить до 500 мг пота. Навески менее 50 мг для анализа не берутся.

После взвешивания фильтровальная бумага заливается 10 мл дистиллированной воды и оставляется на 24 часа для элюирования электролитов. Если вес пота превышает 400 мг, то количество дистиллированной воды увеличивается до 20 мл и это учитывается при расчетах (окончательный результат удваивается).

28

1.Если результаты повторной потовой пробы сомнительны, но сохраняются веские клинические доказательства в пользу MB или выявляются отдельные симптомы, характерные для MB (например: стеаторея), рекомендуется проводить терапию, показанную больным с установленным диагнозом MB. В этих случаях следует периодически повторять потовый тест. Уточнению диагноза может способствовать генетическое тестирование (при условии его доступности).

2.Если не удается получить требуемое количество пота, рекомендуется стимулировать секрецию потовых желез с помощью теплового воздействия, кормления во время сбора пота или физических упражнений. Не следует также забывать о необходимости коррекции дегидратации, если таковая имела место незадолго до проведения потовой пробы. В области отека объем секрета потовых желез может быть сниженным. Повторная стимуляция в одной и той же области может привести к истощению потовых желез, что приводит к повышению концентрации электролитов.

3.Концентрации натрия и хлора в поте обычно примерно одинаковые. Поэтому различия в уровнях натрия и хлора, превышающие 10 ммоль/л, должны настораживать клинициста в отношении возможности технических погрешностей при проведении пробы.

4.У некоторых здоровых новорожденных в первые дни жизни могут отмечаться повышенные концентрации электролитов. Кроме того, сбор пота в этот период часто затруднен. Поэтому рекомендуется проводить потовую пробу не ранее первых 7 дней после рождения, некоторые специалисты предпочитают проводить тест детям старше месяца жизни, при возможности с проведением генетического обследования и определения хлоридов пота в динамике.

5.Несмотря на свою специфичность, метод по ГибсонуКуку является длительным, трудоемким и зависит от опыта проводящего персонала. В связи с этим, постоянно ведутся разработки аппаратов, которые позволили бы унифицировать методику, сократить время проведения теста и уменьшить количество пота, необходимое для постановки диагноза.

29

Системы для анализа проводимости пота (непрямое определение хлоридов). Система для сбора и анализа пота Макродакт в комплексе с потовым анализатором Sweat-Chek компании Wescor (США) позволяет провести потовую пробу вне лабораторных условий и успешно применяется у детей с первых месяцев жизни; время сбора пота составляет 30 мин.

Для обследования новорожденных применяется аппарат Нанодакт (фирма Wescor), объединяющий в себе систему для стимуляции потоотделения путем электрофореза 0,1% раствора пилокарпина и анализатор проводимости пота. Для теста необходимо минимальное количество потовой жидкости (всего 3-6 мкл) можно проводить обследование новорожденных, начиная с 3 дней жизни. Проводимость пота определяется совокупностью всех ионов, присутствующих в потовой жидкости (калий, натрий, хлор, бикарбонат, аммоний и др.), поэтому полученный результат превышает истинную концентрацию хлоридов примерно на 15-20 ммоль/л. Таким образом, положительными считаются результаты выше 80 ммоль/л, а показатели 60-80 ммоль/л рассматриваются как пограничные

Неонатальная диагностика муковисцидоза

Концентрации иммунореактивного трипсина (ИРТ) в крови новорожденных, страдающих MB, почти в 5-10 раз превосходят уровни ИРТ у здоровых детей. Для измерения концентрации ИРТ высушенные пятна крови новорожденных исследуют с помощью радиоиммунного или ферменто-связанного анализа (ELISA или ФСА). Границы между ложно-позитивными и ложнонегативными результатами узкие – <10%. Если планируемая программа неонатальной диагностики включает определение уровня ИРТ, следует учитывать соотношение стоимость/эффективность.

Неонатальная диагностика позволяет:

определить распространенность MB в регионах, в которых диагностика MB находится на недостаточно высоком уровне;

своевременно выявить детей, страдающих MB, и как можно раньше начать соответствующее лечение;

выявить семьи, нуждающиеся в генетической консультации.

30