Molekuljarnaja Biologija Kletki v2
.pdf391
Литература
Цитированная
1.Smith E.L. et al. Principles of Biochemistry: Mammalian Biochemistry, 7th ed, pp. 355 619. New York, McGraw-Hill, 1983. Snyder S. H. The molecular basis of communication between cells. Sci. Am., 253 (4), 132-140, 1985.
2.Norman A. W., Litwack G. Hormones. San Diego, CA, Academic, 1987.
Wilson J. D., Foster D. W. Williams' Textbook of Endocrinology, 7th ed. Philadelphia, Saunders, 1985.
3.Simpson I. A., Cushman S. W. Hormonal regulation of mammalian glucose transport. Annu. Rev. Biochem., 55, 1059-1089, 1986.
4.Beer D. J., Matloff S. M., Rocklin R. E. The influence of histamine in immune and inflammatory responses. Adv. Immunol., 35, 209-268, 1984. Gospodarowicz D., Cheng J., Lui G. M., Baird A., Bohlen P. Isolation of brain fibroblast growth factor by heparin sepharose affinity chromatography: identity with pituitary fibroblast growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963-6967, 1984.
5.Smith W. L., Borgeat P. The eicosanoids: prostaglandins, thromboxanes, leukotrienes, and hydroxyeicosaenoic acids. In: Biochemistry of Lipids and Membranes (D. E. Vance, J. E. Vance, eds.), pp. 325-360. Menlo Park, CA, Benjamin-Cummings, 1985.
6.Evans R. M. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science, 240, 889-895, 1988.
Gehring U. Steroid hormone receptors: biochemistry, genetics, and molecular biology. Trends Biochem. Sci., 12, 399-402, 1987.
Ivarie R. D., O'Farrell P. H. The glucocorticoid domain: steroid-mediated changes in the rate of synthesis of rat hepatoma proteins. Cell, 13, 41-55, 1978.
Yamamoto K. R. Steroid receptor regulated transcription of specific genes and genenetworks. Annu. Rev. Genet., 19, 209-252, 1985.
7.Ashburner M., Chihara C., Meltzer P., Richards G. Temporal control of puffing activity in polytene chromosomes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 38, 655-662, 1974.
8.Attardi В., Ohno S. Physical properties of androgen receptors in brain cytosol from normal and testicular feminized (Tfrn/y♂) mice. Endocrinology, 103, 760-770, 1978.
9.Berridge M. The molecular basis of communication within the cell. Sci. Am., 253 (4), 142-152, 1985.
Kahn C. R. Membrane receptors for hormones and neurotransmitters. J. Cell Biol., 70, 261-286, 1976. Levitski A. Receptors: A Quantitative Approach. Menlo Park, Ca. Benjamin-Cummings, 1984.
Rees Smith В., Buckland P. R. Structure-function relations of the thyrotroprin receptor. In: Receptors, Antibodies and Disease. Ciba Foundation Symposium 90 (D. Evered, J. Whelan, eds.), pp. 114-132. London, Pitman, 1982.
Snyder S. H. The molecular basis of communication between cells. Sci. Am., 253 (4), 132-140, 1985. 10. Pastan I. Cyclic AMP. Sci. Am., 227(2), 97-105, 1972.
Sutherland E. W. Studies on the mechanism of hormone action. Science, 177, 401-408, 1972.
11.Schramm M., Selinger Z. Message transmission: receptor controlled adenylate cyclase system. Science, 225, 1350-1356, 1984.
12.Casperson G.F., Bourne H. R. Biochemical and molecular genetic analysis of hormone-sensitive adenylate cyclase. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 27, 371-384, 1987.
Feder D. et al. Resonstruction of beta1-adrenoceptor-dependent adenylate cyclase from purified components. EMBO J. 5, 1509-1514, 1986. Rodbell M. The role of hormone receptors and GTP-regulatory proteins in membrane transduction. Nature, 284, 17-22, 1980.
13.Oilman A.G. G proteins and dual control of afenylate cyclase. Cell, 36, 577-579, 1984.
Gilman A. G. G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu. Rev.
Biochem., 56, 615 649, 1987. Lai C.-Y. The chemistry and biology of cholera toxin. CRC Crit. Rev. Biochem., 9, 171-206, 1980.
Levitzki A. From epinephrine to cyclic AMP. Science, 241, 800-806, 1988. Stryer L., Bourne H. R. G proteins: a family of signal transducers. Annu. Rev. Cell Biol., 2, 391-419, 1986.
14.Carafoli E. Intracellular calcium homeostasis. Annu. Rev. Biochem., 56, 395-433, 1987. Carafoli E., Penninston J.T. The calcium signal. Sci. Am., 253(5), 70-78, 1985.
392
Evered D., Whelan J., eds. Calcium and the Cell. Ciba Foundation Symposium 122. Chichester, U.K., Wiley, 1986.
Volpe P. et al. "Calciosome", a cytoplasmic organelle: the inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive Ca2 + store of nonmuscle cells? Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 85, 1091-1095, 1988.
15.Augustine G.J., Charlton M.P., Smith S.J. Calcium action in synaptic transmitter release. Annu. Rev. Neurosci., 10, 633-639, 1987. Heilbrunn L. V., Wiercenski F. J. The action of various cations on muscle protoplasm. J. Cell. Соmр. Physiol., 29, 15-32, 1947.
16.Berridge M.J. Inositol lipids and calcium signalling. Pro. R. Soc. Lond. (Biol.), 234, 359-378, 1988.
Cockcroft S. Polyphosphoinositide phosphodiesterase: regulation by a novel guanine nucleotide binding protein, Gp. Trends Biochem. Sci., 12, 75-78, 1987.
Majerus P. W. et al. The metabolism of phosphoinositide-derived messenger molecules. Science, 234, 1519-1526, 1986.
Michell R. H., Putney J. W., eds. Inositol Lipids in Cellular Signaling. Current Communications in Molecular Biology. Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Laboratory, 1987.
Sekar M. C., Hokin L. L. 1 he role of phosphoinositides in signal transduction. J. Membr. Biol., 89, 193-210, 1986.
Woods N. M., Cuthbertson K. S. R., Cobbold P. H. Repetitive transient rises incytoplasmatic free calcium in hormone-stimulated hepatocytes. Nature, 319, 600-602, 1986.
17.Angel P. et al. Phorbol ester-inducible genes contain a common cis element recognized by a TPA-modulated /raws-acting factor. Cell, 49, 729739, 1987.
Bell R. M. Protein kinase С activation by diacylglycerol second messengers. Cell, 45, 631-632, 1986.
Lee W., Mitchell P., Tijan R. Purified transcription factor AP-1 interacts with TPA-inducible enhancer elements. Cell, 49, 741-752, 1987. Nishizuka Y. Studies and perspectives of protein kinase C. Science, 233, 305-312, 1986.
Parker P. J. et al. The complete primary structure of protein kinase С - the major phorbol ester receptor. Science, 233, 853-859, 1986.
18.Barbacid M. ras genes. Annu. Rev. Biochem., 56, 779-827, 1987.
19.Dohlman H.G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. A family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Biochemistry, 26, 26572664, 1987.
Dunlap K., Holz G. G., Rane S. G. G proteins as regulators of ion channel function. Trends Neurosci., 10, 241-244, 1987.
Kubo T. et al. Cloning, sequencing and expression of complementary DNA encoding the muscarinic acetylcholine receptor. Nature, 323, 411416, 1986.
Masu Y. et al. cDNA cloning of bovine substance-K receptor through oocyte expression system. Nature, 329, 836-838, 1987. Stryer L. The molecules of visual excitation. Sci. Am., 257(1), 42-50, 1987.
20.Carpenter G. Receptors for epidermal growth factor and other polypeptide mitogens. Annu. Rev. Biochem., 56, 881-914, 1987.
Kaplan D. R. et al. Common elements in growth factor stimulation and oncogenic transformation: 85 kd phosphoprotein and phosphatidylinositol kinase activity. Cell, 50, 1021-1029, 1987.
Rosen O.M. After insulin binds. Science, 237, 1452-1458, 1987. Schlessinger J. Allosteric regulation of the epidermal growth factor receptor kinase. J. Cell Biol., 103, 2067-2072, 1986.
Yarden Y, Ullrich A. Growth factor receptor tyrosine kinases. Annu. Rev. Biochem., 57, 443-478, 1988.
21. Deuel T.F. Polypeptide growth factors: roles in normal and abnormal cell growth. Annu. Rev. Cell Biol., 3, 443-492, 1987.
Hanks S. K., Quinn A. M., Hunter T. The protein kinase family: conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains. Science, 241, 42-52, 1988. Hunter T. A thousand and one protein kinases. Cell, 50, 823-829, 1987.
Ullrich A. et al. Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Nature, 313, 756-761, 1985.
22.Cohen P. Control of Enzyme Activity, 2nd ed. London. Chapman and Hall, 1983. Edelman A.M., Blumenthal D.K., Krebs E. G. Protein serine/threonine kinases. Annu. Rev. Biochem, 56, 567-613, 1987.
23.Cohen P. Protein phosphorylation and the control of glycogen metabolism in skeletal muscle. Philos. Trans. R. Soc. Lond. (Biol.), 302, 13-25, 1983.
Montminy M. R., Bilezikjian L. M. Binding of a nuclear protein to the cyclic-AMP response of the somatostatin gene. Nature, 328, 175-178, 1987.
Pilkis S. J., El-Maghrabi M. R., Claus Т. Н. Hormonal regulation of hepatic gluconeogenesis and glycolysis. Annu. Rev. Biochem, 57, 755784, 1988.
Smith S. В., White H. D.. Siegel J. В., Krebs E. G. Cyclic AMP-dependent protein
393
kinase I: cyclic nucleotide binding, structural changes, and release of the catalytic subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1591-1595, 1981.
24.Alemany S., Pelech S., Brier ley С. Н., Cohen P. The protein phosphatases involved in cellular regulation. Evidence that dephosphorylation of glycogen phosphorylase and glycogen synthase in the glycogen and microsomal fractions of rat liver are catalysed by the same enzyme: protein phosphatase-1. Eur. J. Biochem., 156, 101-110, 1986.
Ingebritsen T.S., Cohen P. Protein phosphatases: properties and role in cellular regulation. Science, 221, 331 338, 1983.
25.Baku Y.S. et al. Three-dimensional structure of calmodulin. Nature, 315, 37-40, 1985.
Cheung W.Y. Calmodulin. Sci. Am., 246(6), 48-56, 1982.
Gerday C., Gilles R., Bolis L., eds. Calcium and Calcium Binding Proteins. Berlin, Springer-Verlag, 1988.
Klee C.B., Crouch Т.Н., Richman P.O. Calmodulin. Annu. Rev. Biochem., 49, 489-515, 1980.
26.Cohen P. Protein phosphorylation and hormone action. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.), 234 115-144, 1988.
27.Golberg N. D., Haddox M. K. Cyclic GMP metabolism and involvement in biological regulation. Annu. Rev. Biochem., 46, 823 896, 1977. Nakamura Т., Gold G. H. A cyclic nucleotide-gated conductance in olfactory receptor cilia. Nature, 325, 442-444, 1987.
Schnapf J.L., Bay lor D.A. How photoreceptor cells respond to light. Sci. Am., 256, (4), 40-47, 1987. Stryer L. Cyclic GMP cascade of vision. Annu. Rev. Neurosci., 9, 87-119, 1986.
28.Cohen P. Protein phosphorylation and hormone action. Proc. R. Soc, Lond. (Biol.), 234, 115-144, 1988.
29.Schimke R. T. On the roles of synthesis and degradation in regulation of enzyme levels in mammalian tissues. Curr. Top. Cell. Regul., 1, 77124, 1969.
30.Lewis J., Slack J., Wolpert L. Thresholds in development. J. Theor. Biol., 65, 579-590, 1977.
Miller S. G., Kennedy M. B. Regulation of brain type II Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase by autophosphorylation: a Ca2 +-triggered molecular switch. Cell, 44, 861-870, 1986.
Mulvihill E. R., Palmiter R. D. Relationship of nuclear estrogen receptor levels to induction of ovalbumin and conalbumin mRNA in chick oviduct. J. Biol. Chem., 252, 2060-2068, 1977.
31. Lefkowitz R.J., ed. Receptor regulation. Receptors and Recognition. Series B, Vol. 13. London, Chapman and Hall, 1981.
Soderquist A.M., Carpenter G. Biosynthesis and metabolic degradation of receptors for epidermal growth factor. J. Memb. Biol., 90, 97-105, 1986.
32.Sibley D. R., Benovic J. L., Caron M. G., Lefkowitz R. J. Regulation of transmembrane signaling by receptor phosphorylation. Cell, 48, 913-922, 1987.
33.Kassis S., Fishman P. H. Different mechanisms of desensitization of adenylate cyclase by isoproterenol and prostaglandin Et in human fibroblasts: role of regulatory components in desensitization. J. Biol. Chem., 257, 5312-5318, 1982.
Klee W.A., Sharma S.K., Nirenberg M. Opiate receptors as regulators of adenylate cyclase. Life Sci., 16, 1869-1874, 1975. Snyder S.H. Opiate receptors and internal opiates. Sci. Am., 236(3), 44-56, 1977.
34.Adler J. The sensing of chemicals by bacteria. Sci. Am., 234(4), 40-47, 1976. Berg H. How bacteria swim. Sci. Am., 233(2), 36-44, 1975.
35.Koshlad D. E., Jr. Biochemistry of sensing adaptation in a simple bacterial system. Annu. Rev. Biochem., 50, 765-782, 1981.
Russo A.F., Koshland D.E. Receptor modification and absolute adaptation in bacterial sensing. In: Sensing and Response in Microorganisms (M. Eisenbach, M. Balaban, eds.), pp. 27-41. Amsterdam, Elsevier, 1985.
Springer M.S., Goy M.F., Adler J. Protein methylation in behavioral control mechanisms and in signal transduction. Nature, 280, 279-284, 1979.
36.Hess J. F., Oosawa K., Kaplan N., Simon M. I. Phosphorylation of three proteins in the signaling pathway of bacterial chemotaxis. Cell, 53, 7987, 1988.
Oosawa K., Hess J. F., Simon M. L Mutants defective in bacterial chemotaxis show modified protein phosphorylation. Cell, 53, 89-96, 1988.
394
13 Рост и деление клеток
Клетки размножаются путем удвоения своего содержимого с последующим делением надвое. Сложные последовательности клеточных делений, периодически прерываемые слиянием гамет, приводят к образованию многоклеточных организмов. У высших животных и растений даже после достижения ими зрелости клеточное деление обычно необходимо, чтобы восполнять потери в результате «износа» клеток. Во взрослом человеческом организме просто для поддержания нормального состояния каждую секунду должно образовываться несколько миллионов клеток, и если все клеточные деления прекратятся (как, например, при массивном облучении), то человек погибнет через несколько дней.
Удвоение многих компонентов клетки не требует точного контроля. Если в клетке имеется много молекул или органелл определенного типа, то достаточно того, чтобы число их приблизительно удвоилось за один цикл и они затем примерно поровну распределились между двумя дочерними клетками. Однако существует по крайней мере одно очевидное исключение: в случае ДНК такое удвоение и распределение должно быть совершенно точным, а для этого нужен специальный механизм. Поэтому при рассмотрении клеточного цикла иногда удобно бывает различать хромосомный цикл и параллельный ему цитоплазматический цикл. В хромосомном цикле репликация ядерной ДНК (синтез ДНК) чередуется с митозом, в котором разделяются реплицированные копии генома. В цитоплазматическом цикле рост клетки, при котором удваиваются в числе другие клеточные компоненты, чередуется с цитокинезом-делением всей клетки на две.
Мы начнем главу с обсуждения координации и регулирования этих двух взаимосвязанных циклов. Мы рассмотрим механизмы, благодаря которым в период между двумя клеточными делениями вся ядерная ДНК обязательно удваивается, причем только один раз, и увидим, как события хромосомного цикла скоординированы с событиями цитоплазматического цикла. Затем речь пойдет о регуляции клеточного деления у многоклеточных животных факторами внеклеточной среды; этот вопрос существенно прояснился в результате последних успехов в изучении проблемы рака. И наконец, мы обсудим молекулярные механизмы, ответственные за митоз и цитокинез. Для осуществления этих двух процессов необходимо, чтобы центросома (разд. 13.5.2) надежно наследовалась и точно удваивалась для формирования двух полюсов митотического веретена; этот центросомныи цикл можно рассматривать как третий компонент клеточного цикла.
13.1. Фазы клеточного цикла и их причинные взаимосвязи
Под микроскопом деление эукариотической клетки выглядит как поразительный спектакль. При митозе содержимое ядра конденсируется,
395
образуя видимые хромосомы, которые в результате серии удивительно согласованных движений разделяются на два дочерних набора; затем при цитокинезе сама клетка делится на две дочерние, каждая из которых получает один из двух наборов хромосом. Благодаря легкости, с которой их можно наблюдать, митоз и цитокинез были в центре внимания ранних исследователей. Однако эти два события вместе составляют лишь короткую фазу всего клеточного цикла, известную как фаза М (от слова «митоз»). Гораздо более длительный период между двумя последовательными М- фазами известен как интерфаза. Под микроскопом интерфаза обманчиво выглядит как антракт без всякого действия, когда клетка просто медленно увеличивается в размерах. Более изощренные методы позволяют узнать, что на самом деле интерфаза - это период, во время которого в строго заданной последовательности происходят сложные приготовления к митозу. В этом разделе мы обсудим, как можно изучать последовательность событий в интерфазе и каковы причинные взаимосвязи между фазами клеточного цикла.
13-3
13-4 13.1.1. Репликация ядерной ДНК происходит в определенный период, составляющий часть интерфазы [1]
В большинстве клеток синтез ядерной ДНК занимает лишь некоторую часть интерфазы - период, называемый S-фазой клеточного цикла. Обычно между концом М-фазы и началом синтеза ДНК имеется интервал, известный как фаза G1 (от англ, gap-промежуток); другой интервал, называемый фазой G2, отделяет конец синтеза ДНК от начала следующей М-фазы. Таким образом, интерфаза состоит из последовательности фаз G1, S и G2 и обычно занимает не меньше 90% всего времени клеточного цикла. Например, в быстро делящихся клетках
Рис. 13-1. Четыре последовательные фазы клеточного цикла типичной эукариотической клетки. После фазы М, которая состоит в делении ядра (митоз) и цитоплазмы (цитокинез), дочерние клетки вступают в интерфазу нового цикла. Интерфаза начинается с фазы G1, в которой возобновляются интенсивные биосинтетические процессы, резко замедленные во время митоза. Фаза S-это период синтеза ДНК; она заканчивается,
когда содержание ДНК в ядре удвоится и хромосомы полностью реплицируются (теперь каждая хромосома состоит из двух идентичных «сестринских хроматид»). Затем клетка вступает в фазу С2, которая продолжается до начала митоза, т.е. фазы М. В фазе М удвоившиеся хромосомы конденсируются и становятся хорошо видимыми в световой микроскоп. Ядерная оболочка разрушается (исключение составляют одноклеточные эукариоты, например дрожжи, - у них она остается интактной); сестринские хроматиды расходятся и формируют два новых ядра, а цитоплазма делится с образованием двух дочерних клеток, имеющих по одному ядру. Процесс цитокинеза завершает фазу М, и начинается интерфаза следующего клеточного цикла. На рисунке представлен типичный 24-часовой цикл, однако длительность клеточного цикла у высших эукариот сильно варьирует: она может быть короче 8 часов, а у взрослых животных - больше года, причем различия в основном зависят от продолжительности фазы G1.
396
Рис. 13-2. Радиоавтограф, полученный после кратковременной инкубации клеток с 3Н-тимидином. Эта методика описана в разд. 4.5.2. Наличие зерен серебра в фотоэмульсии над ядрами (черные участки) свидетельствует о том, что клетки включали 3Н-тимидин в ДНК и,
следовательно, в период экспозиции какое-то время находились в фазе S. (С любезного разрешения James Cleaver.)
высших эукариот М-фаза обычно повторяется раз в каждые 16-24 ч, а сама длится только от 1 до 2 ч. Типичный клеточный цикл с его четырьмя последовательными фазами показан на рис. 13-1; некоторые подробности приведены в подписи к этому рисунку.
Время синтеза ДНК в клеточном цикле было впервые выявлено в начале 1950-х гг. с помощью метода радиоавтографии. В стандартном методе применяют 3Н-тимидин - радиоактивный предшественник соединения, которое клетка использует исключительно для синтеза ДНК, 3Н- тимидин можно либо инъецировать животному для изучения циклов клеточного деления в тканях, либо добавлять в культуральную среду in vitro (рис. 13-2). В первом случае через определенное время после введения 3Н-тимидина у животного берут ткань и приготовляют из нее радиоавтографы. Те клетки, которые в прошедший период синтезировали ДНК (и, следовательно, находились в S-фазе), могут быть выявлены по зернам серебра над их ядрами. Подсчитывая долю клеток, находившихся в М-фазе, при различной длительности включения 3Н-ти-мидина, можно показать, что в клеточном цикле имеются четыре фазы, описанные выше, и измерить продолжительность каждой из них.
Предположим, что делают одну инъекцию и через короткое время, скажем через полчаса, ткань фиксируют для радиоавтографии. В типичной клеточной популяции, где все клетки делятся быстро, но не синхронно, около 30% клеток получат радиоактивную метку. Это будут те клетки, которые синтезировали ДНК в короткий период экспозиции в присутствии 3Н-тимидина, и их доля в клеточной популяции отражает долю клеточного цикла, занятую S-фазой (рис. 13-3). Только около 5% клеток в момент фиксации окажутся в стадии митоза (малая величина этого митотического индекса означает, что митоз занимает лишь небольшую часть клеточного цикла), но ни в одной из них не будет радиоактивной метки. Это указывает на то, что фазы М и S-обособленные части клеточного цикла. Однако, с другой стороны, если препараты фиксировать через несколько часов после введения 3Н-тимидина, то некоторые клетки, находящиеся в митозе, получат радиоактивную метку; вероятно, эти клетки еще синтезировали ДНК в момент инъекции. Минимальный интервал между инъекцией и временем появления меченых митотических клеток будет равен длительности фазы G2. Такого рода исследования позволяют определить длительность всех четырех фаз цикла. Пример использования этого метода приведен на рис. 13-4.
Длительность клеточных циклов в разных тканях, у разных видов и на разных стадиях очень широко варьирует - она может быть меньше одного часа (например, в раннем эмбрионе лягушки) и больше года (например, в печени взрослого человека). Хотя различаться по длительности в известной степени могут все фазы клеточного цикла, это в особенности касается фазы G1, длительность которой может варьировать в пределах практически от нуля (в раннем зародыше лягушки) до столь больших величин, что клетки кажутся вообще прекратившими деление (в зрелой печени человека). Часто говорят, что клетки в такой покоящейся фазе G1 находятся в состоянии G0 (см. разд. 13.3.8).
13-5
13.1.2. Клеточный цикл легче всего изучать на культурах in vitro [1, 2]
Механизмы, лежащие в основе клеточного цикла, трудно изучать в сложных и недоступных тканях интактного животного. Легче работать с клеточными культурами. Например, с помощью цейтраферной съемки (разд. 4.1.5) можно наблюдать, как отдельная клетка претерпевает митоз, растет, затем опять входит в стадию митоза; это делает воз-
397
Рис. 13-3. Длина каждой фазы клеточного цикла примерно равна доле клеток, находящихся в этой фазе в каждый данный момент, умноженной на общую продолжительность цикла (если популяция клеток растет равномерно и все клетки делятся с одной и той же скоростью). Однако для точного расчета длительности каждой фазы нужен «фактор коррекции», который изменяется в пределах от 0,7 для клеток ранней фазы G1 до 1,4 для митотических клеток. Этот коэффициент необходим потому, что в равномерно растущей популяции всегда больше молодых (недавно
поделившихся) клеток, чем старых.
Рис. 13-4. Метод, используемый обычно для измерения продолжительности фаз клеточного цикла. Несинхронно пролиферирующую клеточную популяцию короткое время выдерживают в среде с 3Н-тимидином, а затем отмывают; при этом клетки продолжают проходить свой цикл. Через разное время после экспозиции берут пробы клеток и получают радиоавтографы. Для интерпретации результатов полезно изобразить клетки так, как будто они распределены на равномерно вращающемся круге, причем положение каждой клетки соответствует стадии цикла, на которой она находится. Вначале клетки в фазе S получают радиоактивную метку (окрашенный участок), а клетки в фазах G2, М и G1 ее не получают. Через промежуток времени, равный длительности G2, меченые клетки начинают вступать в фазу М; когда пройдет время, равное G2 + М, получают метку все клетки, находящиеся в фазе М, и т.д. Отмечая время вступления меченых клеток в фазу М и последующие фазы вплоть до возвращения в
М, в принципе можно определить среднюю длительность фаз G2, М и S и общую продолжительность цикла, а отсюда (путем вычитания) и
длительность G,. В приведенном примере эти величины равны 3, 7, 22 и 11 ч соответственно.
398
Рис. 13-5. Типичные данные, полученные при анализе содержания ДНК в отдельных клетках растущей популяции с помощью флуоресцентного клеточного анализатора - электронного прибора, основанного на том же принципе, что и сортировка флуоресцентно-окрашенных клеток (см. разд. 4.3.1). Клетки окрашивают красителем, приобретающим способность флуоресцировать при связывании с ДНК. Поэтому уровень флуоресценции прямо пропорционален содержанию ДНК в каждой клетке. Клетки подразделяются на три категории: с нереплицированной ДНК (1 условная единица), т.е. находящиеся в фазе G1, с полностью реплицированной ДНК (2 условные единицы), т. е. находящиеся в фазе G2 или М, и с промежуточным содержанием ДНК, находящиеся в фазе S. Распределение клеток в представленном примере показывает, что число клеток в фазе G1
больше, чем в G2 и М, взятых вместе. Это означает, что в данной популяции фаза G1 длиннее, чем G2 + M.
можным прямое измерение длительности М-фазы и всего клеточного цикла. Клетки, осуществляющие синтез ДНК в культуре, можно выявлять таким же образом, как в интактном организме, - методом радиоавтографии с использованием 3Н-тимидина. Можно также прослеживать ход клеточного цикла путем прямого измерения содержания ДНК в клетке; эту задачу сильно облегчает применение флуоресцентного анализатора клеток (рис. 13-5).
Дальнейшее упрощение анализа клеточного цикла состоит в использовании большой популяции культивируемых клеток, одновременно проходящих одни и те же фазы клеточного цикла. Такие синхронные клеточные популяции можно получать разными способами. Самый ранний метод состоял в выдерживании клеток в растворе вещества, нарушающего определенную стадию клеточного цикла; длительное пребывание культуры в таком растворе приводит к тому, что все клетки останавливаются на этой стадии, а после снятия блокады возобновляют цикл и проходят его синхронно. Однако в ходе клеточного цикла параллельно осуществляется много различных процессов, и вряд ли все они будут блокироваться одновременно. Поэтому было бы лучше по возможности применять такие методы получения синхронных популяций, которые не нарушают нормальное прохождение клеточного цикла. Для большинства клеток млекопитающих самый простой и лучший
Рис. 13-6. Обычный метод получения синхронной популяции животных клеток в культуре. Митотические клетки отбирают, стряхивая их с поверхности чашки, в которой они растут. После перенесения в новую чашку эти клетки проходят дальнейшие циклы синхронно. Из-за
случайных различий в скорости деления индивидуальных клеток синхронность после нескольких циклов деления теряется.
399
Рис. 13-7. График увеличения массы клеток за время клеточного цикла. Большая часть клеточных компонентов синтезируется более или менее равномерно на протяжении всей интерфазы, причем скорость их образования обычно возрастает по мере того, как размеры клетки и ее биосинтетическая активность увеличиваются (с коротким перерывом в фазе М). Чтобы в пролиферирующей популяции средняя величина клетки
оставалась постоянной, количество каждого компонента за время цикла должно в точности удваиваться.
метод состоит в том, что используют изменения цитоскелета в М-фазе, приводящие к «округлению» клеток. Округлившиеся в М-фазе клетки так слабо прикрепляются к дну культуральной чашки, что их можно отделить легким встряхиванием (рис. 13-6). Митотические клетки, отобранные таким способом, составляют синхронную популяцию, в которой почти сразу же наступает фаза G1 клеточного цикла. Применяют и другой метод: поскольку клетки по мере прохождения цикла увеличиваются в размерах, можно использовать центрифугирование, чтобы выделить субпопуляции клеток, находящихся на разных стадиях цикла.
13.1.3. Критические события клеточного цикла наступают внезапно на фоне непрерывного роста клеток [3]
На синхронной популяции делящихся клеток можно более детально изучать химические изменения, происходящие в ходе клеточного цикла. При благоприятных для роста условиях общее содержание белка в типичной клетке на протяжении всего цикла увеличивается более или менее непрерывно (рис. 13-7). Синтез РНК тоже происходит с постоянной скоростью, за исключением М-фазы, когда конденсация хромосом, видимо, препятствует транскрипции, так что синтез РНК почти не идет, а образование белка снижается. Анализ синтеза индивидуальных белков (рис. 13-8) показывает, что подавляющее большинство их синтезируется в течение всего цикла. Таким образом, в процессе роста клетки большая часть ее компонентов образуется постепенно и непрерывно - их синтез ненадолго прекращается лишь во время разделения клетки на две.
На фоне этого непрерывного роста происходит ряд резких изменений, связанных с критическими моментами клеточного цикла. Некоторые из них, такие как начало синтеза ДНК, легко выявляются, тогда как другие обнаружить труднее. Оказалось, например, что для большинства клеток существует критическая точка в фазе G1, когда в их клеточном цикле наступает пауза, если условия среды неблагоприятны для роста. При прохождении этой точки, называемой точкой рестрикции, в клетке происходят внутренние изменения, после которых она должна уже пройти все последующие этапы клеточного цикла в соответствии с жестким временным «расписанием».
Как и следовало ожидать при наличии в цикле ряда критических точек, можно выделить определенные белки (хотя их очень немного), синтез которых резко ускоряется на специфических стадиях цикла (см. рис. 13-8). Например, гистоны, необходимые для построения нового хроматина, синтезируются с высокой скоростью только в S-фазе; это, видимо, относится и к некоторым белкам аппарата репликации ДНК.
Но чем определяется время наступления такого рода критических событий и как они координируются между собой и с непрерывным процессом клеточного роста? Чтобы ответить на эти вопросы, мы вначале посмотрим, что служит пусковым сигналом для синтеза ДНК, т. е. для перехода к S-фазе клеточного цикла.
13.1.4. Синтез ДНК запускается изменением в цитоплазме-появлением активатора S-фазы [4]
Путем добавления надлежащего агента к культуральной среде (разд. 4.3.5) можно вызвать слияние клеток двух синхронизированных клеточных популяций, находящихся в разных фазах клеточного цикла. Результаты такого опыта чрезвычайно информативны.
Когда клетка в S-фазе сливается с клеткой, находящейся на более ранней стадии G1 , ядро клетки в фазе G1 немедленно приступает к синтезу ДНК (рис. 13-9, А). Очевидно, что это ядро уже готово
400
Рис. 13-8. Анализ белков, синтезируемых в фазах G1 и S, с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Синхронизированные клетки мышиной лимфомы в течение короткого времени в ранней фазе G1 или в поздней S-фазе метили смесью
радиоактивных аминокислот. На представленных радиоавтографах можно выявить около 1000 вновь синтезированных белков, но только два из них (отмечены кружком и квадратом) образуются в этих двух фазах с существенно разными скоростями. Поскольку гистоны имеют сильный положительный заряд, они мигрируют за пределы геля и здесь не видны. (P. Coffino, V. Е. Groppi, Adv. Cyclic Nucleotide Res. 14: 399-410, 1981.)
к репликации ДНК, но в нормальных клетках G1 еще отсутствует какой-то сигнал (или ряд сигналов), необходимый для активации механизма синтеза ДНК. По-видимому, в цитоплазме клеток, находящихся в S-фазе, такой сигнальный фактор содержится в большом количестве. Появление такого активатора S-фазы, очевидно, и отмечает границу между фазами G1 и S в нормальной клетке.
Исчезает ли активатор S-фазы после завершения синтеза ДНК и перехода клетки в фазу G2? Ответ можно опять-таки получить в опытах со слиянием клеток. Когда клетка в фазе G2 сливается с клеткой в фазе Gl (рис. 13-9,Б), ядро клетки G1 не начинает преждевременно синтезировать ДНК; но если такая же клетка G2 сливается с клеткой в S-фазе, то в ядре этой последней репликация ДНК продолжается (рис. 13-9, А). Очевидно, что активатор S-фазы (или какой-то его важный компонент) вскоре после окончания этой фазы исчезает и цитоплазма клеток в фазе G2 уже не содержит ни диффундирующего активатора, ни диффундирующего ингибитора синтеза ДНК.
13.1.5. В каждом цикле весь геном реплицируется только один раз [4, 5]
Как уже говорилось в гл. 9 (разд. 9.3.6), разные части генома реплицируются в разные моменты S-фазы и после этого не могут реплицироваться повторно, так как этому препятствует какое-то химическое
Рис. 13-9. Сводная схема различных результатов слияния двух клеток млекопитающих, находящихся на разных фазах клеточного цикла.