Molekuljarnaja Biologija Kletki v2
.pdf
501
Рис. 14-41. Микрофотография участка между двумя кусочками сердца куриного эмбриона. Эти эксплантаты, содержавшие много фибробластов и мышечных клеток, росли на коллагеновом геле в течение 4 дней. Обратите внимание, что между эксплантатами образуется плотная
полоса из параллельных коллагеновых волокон. (D. Stopak, А. К. Harris. Dev. Biol. 90: 383-398, 1982.)
собой фибриллы из окружающего геля и последний сожмется до малой доли своего первоначального объема. Подобным же способом группа фибробластов может окружить себя капсулой из плотно упакованных коллагеновых волокон, ориентированных тангенциально.
Если два кусочка эмбриональной ткани с фибробластами поместить на некотором расстоянии друг от друга на коллагеновый гель, то коллаген организуется в компактную полосу ориентированных волокон, соединяющих оба эксплантата (рис. 14-41). Затем фибробласты будут мигрировать из обоих эксплантатов вдоль этих параллельных волокон. Таким образом, фибробласты влияют на расположение коллагеновых волокон, а эти волокна в свою очередь воздействуют на распределение фибробластов. Вполне возможно, что фибробласты играют сходную роль и в организации внеклеточного матрикса на макроуровне, участвуя, например, в создании сухожилий и связок, а также прочных, плотных слоев соединительной ткани, окружающих и скрепляющих большинство органов.
14.2.11. Молекулы коллагена типа IV организованы в ламинарную сеть [19]
Молекулы коллагена типа IV в некоторых отношениях отличаются от фибриллярного коллагена. Во-первых, регулярная повторяющаяся последовательность аминокислот Gly-X-Y в α-цепи типа IV во многих участках прерывается, локально нарушая спиральную трехцепочечную структуру молекулы коллагена. Во-вторых, молекулы «проколлагена» типа IV не расщепляются после выхода из клетки и, таким образом, сохраняют свои пропептиды; взаимодействуя через неотщепленные пропептидные домены, они организуются в пластоподобную многослойную сеть, а не в фибриллы. Электронно-микроскопические исследования показывают, что эти молекулы, по-видимому, ассоциируются пропептидами своих карбоксильных концов в димеры, которые при дальнейшей ассоциации образуют обширную сеть (рис. 14-42). Дисульфидные и другие ковалентные сшивки стабилизируют такие ассоциации. По-видимому, слои коллагена типа IV составляют основу всех базальных мембран; другие компоненты базальной мембраны будут обсуждаться позже (разд. 14.2.15).
502
Рис. 14-42. Гипотетическая схема сборки молекул коллагена IV в многослойную сеть, составляющую основу всякой базальной мембраны. Модель основана на электронных микрофотографиях препаратов (с круговым напылением) таких молекул в процессе их сборки in vitro. (По
данным P. D. Yurchenco, Е. С. Tsilibary, A. S. Charonis, H. Furthmayr. J. Histochem. Cytochem. 34: 93-102, 1986.)
14.2.12. Эластин-это белок с изменчивой случайной конформацией и поперечными сшивками, придающий тканям упругость [20]
Некоторые ткани, например кожа, кровеносные сосуды и легкие, должны быть не только прочными, но и эластичными. Обширная сеть эластических волокон внеклеточного матрикса придает этим тканям необходимую им способность сжиматься после временного растяжения. Главный компонент таких волокон - эластин - это весьма гидрофобный негликозилированный белок (около 830 аминокислотных остатков в длину), который, подобно коллагену, необычайно богат пролином и глицином, но в отличие от коллагена содержит очень мало гидроксипролина и совсем не содержит гидроксилизина. Молекулы эластина секретируются во внеклеточное пространство, где образуют волокна и слои, в которых эти молекулы связаны множеством сшивок в разветвленную сеть (рис. 14-43). Сшивки образуются между остатками лизина с помощью того же механизма, что и в коллагене (см. рис. 14-38). Функция эластина (в отличие от функции большинства других белков) требует того, чтобы его пептидные цепи оставались развернутыми и сохраняли гибкую случайную конформацию (рис. 14-44). Именно такая структура сети из сшитых между собой, произвольным образом изогнутых эластических волокон позволяет всей сети растягиваться и снова сжиматься, подобно
503
Рнс. 14-43. Густая сеть эластических волокон в срезе соединительной ткани кожи (дермы) человека. Микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. Для того чтобы убрать коллаген и гликоз-аминогликаны, ткань подвергали нагреву под
давлением. (Т. Tsuji, R. М. Lavker, A. M. Kligman. J. Microscop. 115: 165-173, 1978.)
Рис. 14-44. Схема различных случайных конформаций молекулы эластина. В отличие от большинства белков эластин не приобретает какой-то уникальной структуры, а постоянно переходит от одной частично развернутой случайной конформаций к другой, третьей и т.д.
Рис. 14-45. Молекулы эластина связаны ковалентными сшивками (выделенными цветом) в обширную сеть. Поскольку каждая молекула в такой сети способна растягиваться и сжиматься, то и вся сеть растягивается и сжимается, подобно резине.
резиновой ленте (рис. 14-45). Эластиновые волокна могут растягиваться по крайней мере в пять раз больше, чем резиновая лента такого же поперечного сечения. Вплетенные в сеть эластических волокон длинные нерастяжимые коллагеновые фибриллы ограничивают растяжимость всей сети и тем самым предотвращают разрыв ткани.
Эластические волокна состоят не только из эластина. Они содержат также гликопротеин, который в основном распределен в виде микрофибрилл по поверхности волокна. Эластические волокна формируются в тесной связи с плазматической мембраной клетки, секретирующей эластин и микрофибриллярный гликопротеин. Микрофибриллы появ-
504
ляются раньше самого эластина и, возможно, помогают клетке организовать из выделяемых ею молекул эластина волокна и слои, образующиеся во внеклеточном матриксе.
14-14
14.2.13. Фибронектин внеклеточный гликопротеин, способствующий адгезии между клеткой и матриксом [21]
Внеклеточный матрикс содержит несколько адгезивных гликопротеинов, которые связываются и с клетками, и с другими макромолекулами матрикса, способствуя прикреплению клеток к матриксу. Из них лучше всего охарактеризован фибронектнн - крупный, образующий фибриллы гликопротеин, встречающийся во всем животном царстве. Это димер, состоящий из двух одинаковых субъединиц (каждая почти из 2500 аминокислотных остатков); субъединицы соединены парой дисульфидных связей вблизи от карбоксильных концов и свернуты в серию глобулярных доменов, разделенных участками гибкой полипептидной цепи (рис. 14-46). Как показывает секвенирование, молекула фибронектина состоит в основном из трех коротких много раз повторяющихся последовательностей аминокислот, и это позволяет предполагать, что ген, кодирующий фибронектин, образовался в результате многократной дупликации трех малых генов.
Существуют три формы фибронектина: 1) растворимая димерная форма (фибронектин плазмы}, которая циркулирует в крови и тканевых жидкостях и, как полагают, способствует свертыванию крови, заживлению ран и фагоцитозу; 2) олигомеры фибронектина, которые могут быть временно прикреплены к поверхности клеток (поверхностный фибронектин); 3) труднорастворимая фибриллярная форма фибронектина во внеклеточном матриксе (матриксный фибронектин). В поверхностных
Рис. 14-46. А. Схематическое изображение структуры димера фибронектина. Б. Электронные микрофотографии отдельных молекул, напыленных платиной. Две полипептидные цепи сходны, но не идентичны; вблизи карбоксильного конца они соединены двумя дисульфидными
связями. Каждая цепь свернута в ряд глобулярных доменов, соединенных гибкими полипептидными сегментами. Отдельные домены предназначены для связывания с той или иной молекулой или клеткой (это указано для трех доменов). Для простоты отмечены не все известные участки связывания. [Б-J. Engel et al. J. Моl. ВіоІ. 150: 97-120, 1981. Copyright Academic Press Inc. (London) Ltd.]
505
и матриксных агрегатах димеры фибронектина связаны друг с другом дополнительными дисульфидными сшивками.
Фибронектин - многофункциональная молекула, в которой различные глобулярные домены играют разную роль. Например, один домен связывается с коллагеном, другой - с гепарином, третий - со специфическими рецепторами на поверхности клеток различных типов и т. д. (см. рис. 14-46). Таким образом фибронектин участвует в организации матрикса и способствует прикреплению к нему клеток.
Роль различных доменов, в особенности доменов, связывающихся с клетками, была изучена путем расщепления молекулы на отдельные домены протеолитическими ферментами или путем синтеза специфических белковых фрагментов химическим методом или с помощью рекомбинантных ДНК. Так, из протеолитических фрагментов был выделен домен, ответственный за связывание с клеткой, и определена его аминокислотная последовательность. Были приготовлены синтетические пептиды, соответствующие различным сегментам этого домена, и удалось выяснить, что за связывающую активность ответственна специфическая трипептидная последовательность (Arg-Gly-Asp, или R-G-D). Пептиды, содержащие эту RGD-последовательность, конкурируют за места связывания на клетке и таким образом ингибируют прикрепление клеток к фибронектину; когда же эти пептиды связываются с твердой поверхностью, они обусловливают прикрепление к ней клеток. RGDпоследовательность содержится не только в фибронектине - она является общей для многочисленных внеклеточных адгезивных белков и узнается целым семейством гомологичных рецепторов клеточной поверхности, связывающих эти белки (разд. 14.2.17). Хотя в молекулах, узнаваемых этими рецепторами, имеется общая трипептидная последовательность, каждый рецептор специфически узнаёт свою собственную небольшую группу адгезивных молекул; таким образом, связывание с рецептором должно также зависеть и от других участков адгезивной белковой последовательности.
Фибронектин важен не только для клеточной адгезии, но и для миграции клеток. В зародышах беспозвоночных и позвоночных он, повидимому, во многих случаях направляет миграцию. Например, большие количества фибронектина находятся вдоль пути передвижения клеток проспективной мезодермы при гаструляции у амфибий (разд. 16.1.4). Миграцию этих клеток можно подавить либо путем инъекции в бластоцель антител к фибронектину, либо путем введения полипепти-дов, содержащих трипептид, связывающийся с клетками, но без тех доменов фибронектина, которые связываются с матриксом. Полагают, что фибронектин способствует миграции клеток, помогая их прикреплению к матриксу. Такое действие должно быть тонко сбалансировано так, чтобы сцепление клеток с матриксом происходило, но не приводило к их иммобилизации. Позднее мы вернемся к вопросу о том, как может быть достигнут такой баланс многочисленными адгезивными молекулами, которые участвуют в определении путей морфогенетических движений.
14.2.14. Множественные формы фибронектина синтезируются при альтернативном сплайсинге РНК [22]
Фибронектин, будучи представителем обширного семейства RGD-coдержащих адгезивных молекул, и сам по себе, как уже отмечалось, может существовать во многих формах; даже в одном димере полипептидные цепи могут слегка различаться. И тем не менее все различные полипептидные цепи фибронектина кодируются одним большим геном; у крысы его длина составляет более 70 тысяч п. н., и он содержит около 50 экзонов, т. е. это один из самых крупных генов охарактеризованных
506
до настоящего времени. При транскрипции получается одна длинная молекула РНК, которая подвергается сплайсингу в разных вариантах, при которых в зависимости от типа клеток образуется одна или несколько из примерно 20 различных мРНК. Неясно, чем определяется выбор вариантов сплайсинга РНК и каковы функциональные различия получающихся при этом полипептидных цепей. Судя по некоторым данным, одной из функций альтернативного сплайсинга РНК-транскрипта для фибронектина человека состоит в добавлении к определенным молекулам фибронектина дополнительного связывающегося с клетками домена, отличного от RGD-содержащего участка.
Фибронектин - не единственный секретируемый гликопротеин, участвующий в адгезии между клетками и матриксом. Например, тенасцин тоже является внеклеточным адгезивным гликопротеин ом, однако он встречается значительно реже, чем фибронектин, и наиболее обычен в эмбриональных тканях. В нервной системе он секретируется глиальными клетками, и полагают, что некоторые нейроны связываются с ним через посредство специфического протеогликана клеточной поверхности. Тенасцин представляет собой крупный комплекс из шести связанных дисульфидными сшивками полипептидных цепей, расходящихся из центра, подобно спицам колеса (см. рис. 14-51).
Некоторые клетки, особенно эпителиальные, секретируют внеклеточный адгезионный гликопротеин иного типа, называемый ламинином, который является одним из основных белков всех базальних мембран. Он связывается как с эпителиальными клетками (а также с клетками некоторых других типов), так и с коллагеном типа IV-главным типом коллагена в базальной мембране.
14.2.15. Базальная мембрана-это специализированная форма внеклеточного матрикса, содержащая в основном коллаген типа IV, протеогликаны и ламинин [23]
Базальная мембрана представляет собой тонкий слой специализированного внеклеточного матрикса, подстилающий пласты эпителиальных клеток; кроме того, она окружает отдельные мышечные волокна, жировые клетки и шванновские клетки (которые, наматываясь на перифери-
Рис. 14-47. Три варианта расположения базальной мембраны (представлена черной линией). Базальная мембрана клетки может окружать (например, мышечные), подстилать слои эпителиальных клеток или располагаться между двумя клеточными слоями (как в почечных клубочках). Обратите внимание, что в почечных клубочках в обоих слоях клеток имеются разрывы, так что барьером проницаемости, определяющим, какие молекулы из крови перейдут в мочу, служит базальная мембрана. Поскольку в клубочках эта мембрана-результат слияния двух базальных мембран,
образованных эндотелиальными и эпителиальными клетками, то она вдвое толще большинства таких мембран.
507
Рис. 14-48. Базальная мембрана роговицы куриного эмбриона. Микрофотография, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. Часть эпителиальных клеток (Эп) была удалена, чтобы показать верхнюю поверхность базальной мембраны (БМ). Обратите внимание,
что с нижней поверхностью мембраны взаимодействует густая сеть коллагеновых фибрилл (К). Макромолекулы базальной мембраны синтезируются лежащими на ней эпителиальными клетками. (С любезного разрешения Robert Trelstad.)
Рис. 14-49. А. Электронные микрофотографии молекул ламинина (препарат, напиленный платиной). Б, Схема структуры ламинина. Этот мультидоменный гликопротеин состоит из трех полипептидных цепей (А, В, и В2), соединенных дисульфидными связями в форме асимметричного креста. [A-J. Engel et al. J. Моl. BioL, 150, 97-120, 1981. Copyright Acad. Press Inc. (London) Ltd; Б-по В.L. Hogan et al. In: Basement Membranes (S.
Shibata, ed.), pp. 147-154. Amsterdam, Elsevier, 1985.]
ческие нервные волокна, образуют миелин). Таким образом, базальная мембрана отделяет эти клетки или клеточные слои от окружающей или подстилающей их соединительной ткани. В других местах, например в почечных клубочках или легочных альвеолах, базальная мембрана расположена между двумя различными слоями клеток и служит здесь высокоэффективным фильтром (рис. 14-47). Однако роль базальных мембран не сводится просто к функциям структурной опоры и фильтра. Они способны определять полярность клеток, влиять на клеточный метаболизм, упорядочивать белки в прилегающих плазматических мембранах, вызывать дифференцировку клеток и, подобно фибронектину, служить специфическими «магистралями» для клеточных миграций.
Базальная мембрана в основном синтезируется лежащими на ней клетками (рис. 14-48). Это, по существу, плотная прослойка из коллагена типа IV (см. рис. 14-42) с дополнительными специфическими молекулами по обе ее стороны, которые способствуют прикреплению ее к соседним клеткам или матриксу. Хотя состав базальных мембран несколько меняется от ткани к ткани и даже от участка к участку (разд. 14.2.17), все эти мембраны содержат коллаген типа IV вместе с протеогликанами (в
508
Рис. 14-50. Структура базальной мембраны, подстилающей эпителиальные клетки, как она видна на поперечных срезах в электронном микроскопе.
Рис. 14-51. Сравнение формы и размеров некоторых важнейших макромолекул внеклеточного матрикса.
основном гепарансульфатами) и гликопротеинами лиминином и энтактином. Ламинин представляет собой крупный (мол. масса около 850000) комплекс из трех очень длинных полипептидных цепей, расположенных в форме креста и удерживаемых вместе дисульфидными связями (рис. 1449). Подобно фибронектину, он состоит из нескольких функциональных доменов: один из них связывается с коллагеном типа IV, один - с гепарансульфатом и один или несколько других - с белковыми рецепторами ламинина на клеточной поверхности. Полагают также, что с каждой молекулой ламинина прочно связана одна гантелевидная молекула энтактина в месте соединения коротких ветвей «креста» с длинной ветвью.
Как видно на электронно-микроскопических препаратах после обычной фиксации и контрастирования, большинство базальних мембран состоит из двух слоев: электронопрозрачного слоя (lamina lucida, или гага), прилегающего к плазматической мембране клеток, находящихся на базальной мембране (обычно это эпителиальные клетки), и лежащего под ним электроноплотного слоя (lamina densa). В некоторых случаях имеется еще третий слой, содержащий коллагеновые фибриллы (lamina reticularis) и связывающий базальную мембрану с подлежащей соединительной тканью. Некоторые авторы называют «базальной мембраной» весь комплекс из трех слоев (рис. 14-50), толщина которого обычно достаточна для того, чтобы его можно было видеть в обычный микроскоп. Детальная молекулярная организация базальной мембраны еще не исследована, хотя электронная микроскопия с использованием меченых антител показывает, что lamina densa, по-видимому, состоит в основном из коллагена типа IV с молекулами протеогликана на обеих ее сторонах; как полагают, ламинин присутствует главным образом на той стороне lamina densa, которая обращена к плазматической мембране, где он участвует в прикреплении эпителиальных клеток к базальной мембране, тогда как фибронектин помогает связыванию макромолекул матрикса и клеток соединительной ткани на противоположной стороне.
На рис. 14-51 сравниваются размеры и форма некоторых важнейших макромолекул базальной мембраны.
509
14.2.16. Вязальные мембраны выполняют многообразные и сложные функции [24]
Функции базальной мембраны чрезвычайно разнообразны. В почечных клубочках необычно толстая базальная мембрана работает как молекулярный фильтр, регулируя переход молекул из крови в мочу (см. рис. 14-47). Для этой функции, по-видимому, необходимы протеогликаны, так как их удаление с помощью специфических ферментов ведет к утрате фильтрующих свойств мембраны. Базальная мембрана может также служить избирательным барьером для клеток. Например, базальная мембрана, подстилающая эпителиальный слой, обычно предотвращает контакт фибробластов подлежащей соединительной ткани с эпителиальными клетками, но не препятствует прохождению через нее макрофагов, лимфоцитов и нервных волокон.
Базальная мембрана играет важную роль в процессе регенерации ткани после повреждения. При нарушении целости мышечной, нервной или эпителиальной ткани сохранившаяся базальная мембрана служит субстратом для миграции регенерирующих клеток. Таким образом легко восстанавливается исходная архитектура ткани. Наиболее яркий пример роли базальной мембраны в регенерации мы находим при изучении нервномышечного соединения, в котором нервная клетка передает стимул волокну скелетной мышцы.
В месте нервно-мышечного контакта (синапса) базальная мембрана имеет особое химическое строение, распознаваемое, например, антителами, которые связываются с ней исключительно в этом участке. Одна из функций базальной мембраны здесь состоит, по-видимому, в координировании пространственной организации компонентов по обе стороны синапса. Данные в пользу центральной роли базальной мембраны синаптического соединения в восстановлении синапса после повреждения мышцы или нерва будут обсуждаться в гл. 19 (разд. 19.8.3). Такие исследования ясно показывают, что мы еще многого не знаем о химической и функциональной специализации базальной мембраны. Они позволяют также предположить, что минорные (но пока не идентифицированные) компоненты внеклеточного матрикса могут играть решающую роль в управлении процессами морфогенеза в эмбриональном развитии.
14.2.17. Интегрины способствуют связыванию клеток с внеклеточным матриксом [25]
Чтобы понять, как внеклеточный матрикс взаимодействует с клетками, нужно изучить молекулы клеточной поверхности, связывающиеся с компонентами матрикса, а также молекулы самого матрикса. Как уже отмечалось, некоторые протеогликаны являются интегральными компонентами плазматической мембраны; их сердцевинный белок либо пронизывает липидный бислой, либо ковалентне присоединен к нему. Связываясь с большинством компонентов внеклеточного матрикса, эти протеогликаны способствуют прикреплению клеток к матриксу. Однако компоненты матрикса тоже прикрепляются к клеточной поверхности с помощью специфических рецепторных протеогликанов. Ввиду таких сложных взаимодействий между макромолекулами матрикса во внеклеточном пространстве вопрос о том, где кончаются компоненты плазматической мембраны и где начинается внеклеточный матрикс, - в значительной степени семантический. Например, гликокаликс клетки часто состоит из компонентов обеих этих структур (см. разд. 6.3.1).
Рецепторы матрикса отличаются от поверхностных клеточных рецепторов для гормонов и других растворимых сигнальных молекул тем,
что
510
связывают свои лиганды с относительно низким сродством (Ка = 106-108 л/моль), и тем, что их концентрация на поверхности клеток примерно в 10100 раз больше. Поэтому такие рецепторы, вероятно, могут функционировать кооперативно, а клетки могут отвечать на организованную группу лигандов в матриксе, а не на отдельные молекулы. В пользу этого предположения говорит то, что растворимые фрагменты матрикса, прикрепляющиеся к клеткам, обычно не вызывают у клетки ответ, вызываемый теми же компонентами, закрепленными в матриксе.
Рецептор фибронектина на фибробластах млекопитающих - один из наиболее изученных рецепторов для компонентов матрикса. Первоначально он был идентифицирован как гликопротеин плазматической мембраны, который связывается в колонке с фибронектином и может быть элюирован с помощью небольшого белка, содержащего прикрепляющуюся к клетке последовательность RGD (разд. 14.2.13). Рецептор представляет собой нековалентно связанный комплекс из двух различных высокомолекулярных полипептидных цепей, называемых α- и β-цепями. Он работает как трансмембранный линкер, осуществляя взаимодействие между актином цитоскелета внутри клетки и фибронектином во внеклеточном матриксе (рис. 14-52). Позднее мы увидим, что такие взаимодействия через плазматическую мембрану могут поляризовать и клетку и матрикс. Было охарактеризовано много других рецепторов для матрикса, в том числе таких, которые связывают коллаген и ламинин, и показано, что они родственны рецептору фибронектина на фибробластах. Называемые интегринами, все они являются гетеродимерами с α- и β-цепями, гомологичными цепям рецептора для фибронектина. Вероятно, большинство из них узнаёт последовательности RGD в компонентах матрикса, с которыми они связываются.
Имеется по крайней мере три семейства в огромном суперсемействе интегринов; члены одного семейства имеют одну общую α-цепь, но различаются своими β-цепями. Одно из семейств включает рецептор фибробластов для фибронектина и по меньшей мере еще пять других членов. Другое семейство включает рецептор на кровяных пластинках, связывающий некоторые компоненты матрикса, в том числе фибронектин и фибриноген - белок, взаимодействующий с пластинками в процессе свертывания крови: при болезни Гланцмана - наследственном дефиците этих рецепторов - у больных плохо свертывается кровь. Третье семейство интегринов составляют рецепторы, находящиеся главным образом на поверхности лейкоцитов; один из них носит название LFA-1 (lympho-
Рис. 14-52. Рецептор фибронектина на клеточной поверхности и его субъединицы. Судя по электронным микрофотографиям изолированных рецепторов, форма молекулы близка к изображенной на рисунке. Глобулярная «головка» выступает над липидным бислоем более чем на 20 нм. Связываясь с фибронектином снаружи и с цитоскелетом внутри клетки (через прикрепительный белок талин), рецептор действует как
трансмембранный линкер. Обе цепи, α и β, гликозилированы (на схеме не показано) и удерживаются вместе нековалентными связями. Первоначально α-цепь синтезируется в виде одной полипептидной цепи с мол. весом 140000, которая затем расщепляется на малую трансмембранную цепь и большую внеклеточную цепь, соединенные дисульфидной связью. Внеклеточная часть β-цепи состоит из повторяющихся участков, богатых цистеином, что указывает на большое число межцепочечных дисульфидных связей (не показаны). Рецептор фибронектина принадлежит к обширному суперсемейству гомологичных рецепторов для матрикса, называемых интегринами, большинство из которых узнает последовательности RGD связываемых ими внеклеточных белков.