Molekuljarnaja Biologija Kletki v2

421

Рис. 13-28. Зависимость клеточного деления от размеров клеток и от их прикрепления. В представленном на этом рисунке опыте клетки растут либо в суспензии, либо прикрепленными к участкам адгезивного материала (палладия) на неадгезивной поверхности; от величины этих участков зависит степень распластывания клеток и возможность их деления. В культуральную среду добавляли 3Н-тимидин и спустя 1-2 дня фиксировали культуру и получали радиоавтографы для определения процента клеток, перешедших в фазу S. А. Округленные клетки линии ЗТЗ в суспензии делятся очень редко, но прикрепление к очень малому участку - такому, что он не позволяет клетке распластаться, дает им возможность

делиться значительно чаще. Б и В. Снимки, сделанные с помощью сканирующего электронного микроскопа, позволяют сравнить клетку, распластанную на большом адгезивном участке, с клеткой, прикрепленной к маленькому участку. (Фотографии из С. O'Neill, P. Jordan, G. Ireland, Cell 44: 489-496, 1986. Copyright Cell Press.)

скелета. Хотя механизм и функции этой связи не ясны, можно думать, что зависимость деления клеток от их прикрепления, вероятно, позволяет ткани сохранять целостность и предотвращает пролиферацию клеток, обособившихся от нормального окружения.

13.3.7. Деление клеток сопровождается изменениями в межклеточных соединениях

Зависимость между прикреплением клетки и ее делением имеет несколько аспектов. С одной стороны, для большинства нормальных клеток позвоночных необходимо прикрепление, чтобы перейти точку рестрикции; с другой стороны, для клеток, уже прошедших эту точку, для окончания цикла деления прикрепление необязательно - обычно они при этом теряют контакты и округляются, переходя в М-фазу. Этот цикл прикрепления и открепления, вероятно, позволяет перегруппировать адгезивные кантакты как между клетками, так и между клетками и матриксом, чтобы встроить вновь возникшие дочерние клетки в ткань, перед тем как они смогут начать следующий цикл деления.

Ослабление контактов, видимо, составляет важную особенность пролиферативного поведения большинства типов клеток. Например, в ранней стадии реакции фибробластов на PDGF отмечается разрушение их фокальных контактов (разд. 13.4.6). Поразительно то, что потеря управляемости роста у раковых клеток почти всегда связана с необратимым уменьшением клеточной адгезивности, которое проявляется также в потере фокальных контактов при выращивании таких клеток в культуре. Связь между клеточным делением и прикреплением - весьма запутанная проблема, о чем мы будем говорить позднее; этим обусловлен и существенный пробел в нашем понимании трансформации, превращающей нормальную клетку в раковую (разд. 13.4.7).

423

Рис. 13-29. Сравнение размеров нейрона из сетчатки млекопитающего и лимфоцита; обе клетки содержат одинаковое количество ДНК. В процессе развития нейрон растет непрерывно, оставаясь в состоянии G0. За это время отношение цитоплазмы к ДНК чрезвычайно сильно возрастает

(для некоторых нейронов с коэффициентом 10s). [В. В. Boycott. In: Essay on the Nervous System (B. Bellairs and E. G. Gray eds.). Oxford, U. K. Clarendon Press, 1974]

и меньшее количество РНК, чем соответствующие клетки GJ, и синтез белка у них идет более чем в два раза медленнее. Когда факторы роста стимулируют клетку G0 к пролиферации, изменение скорости белкового синтеза у нее обычно коррелирует с воздействием на хромосомный цикл: так же как и у дрожжей, рост и деление клетки координируются так, чтобы поддерживались нормальные размеры клеток.

Однако связь между синтезом белка и хромосомным циклом не жесткая. При подходящей комбинации ингибиторов белкового синтеза и факторов роста у культивируемых клеток можно подавить белковый синтез без задержки в прохождении хромосомного цикла или, наоборот, стимулировать синтез белков без стимуляции клеточного деления. Кроме того, специализированные клетки разных типов очень сильно различаются по ядерно-плазменному отношению, и некоторые клетки в состоянии G0, такие как нейроны, могут почти неограниченно расти без репликации ДНК (рис. 13-29).

13-17

13.3.10. Вероятность перехода в G0 обычно увеличивается с числом клеточных делений: старение клетки [25]

У млекопитающих и птиц большинство нормальных клеток проявляет поразительную несклонность делиться неопределенно долго. Это отличает их от стабильных культивируемых клеточных линий, таких как ЗТЗ, в которых, видимо, произошли какие-то генетические изменения, делающие их «бессмертными». Например, фибробласты, взятые от человеческого плода, при выращивании в стандартной среде осуществляют только около 50 удвоений популяции; к концу этого периода пролиферация замедляется и затем останавливается, и все клетки, пробыв некоторое время в состоянии покоя, погибают. Такие же клетки, взятые от 40-летнего человека, перестают делиться примерно после 40 удвоений, а от 80летнего - примерно после 30 удвоений. Фибробласты от животных с более короткой продолжительностью жизни прекращают деление в культуре после меньшего числа циклов. По аналогии со старением организма в целом это было названо клеточным старением. Клеточное старение представляет собой загадочный феномен. Короткие запрограммированные серии клеточных делений, которые заканчиваются дифференцировкой, - характерная особенность эмбрионального развития {разд. 16.3.4), однако трудно представить себе, как клетки могли бы в течение долгого времени отсчитывать свои митотические циклы и останавливаться, пройдя, скажем, 50 делений. Согласно одной из теорий, клеточное старение - это результат катастрофического накопления самовоспроизводящихся ошибок биосинтетических механизмов клетки; эти ошибки несущественны в природных условиях, где большинство животных гибнет от других причин задолго до того, как у них подвергнется старению значительное число клеток. С этой точки зрения клеточное старение просто отражает черты несовершенства в физиологии клетки, которые вполне естественны при очень слабом давлении отбора, направленного на их элиминацию. Однако в этом случае необходимо было бы объяснить, каким же образом клетки зародышевого пути, «бессмертные» клетки культивируемых линий и даже обычные соматические клетки при некоторых специальных условиях (описанных ниже) способны к бесконечной пролиферации. Другая гипотеза состоит в том, что клеточное старение-это результат механизма, который выработался для защиты от рака путем ограничения роста опухолей. Однако подобная защита представлялась бы неэффективной, так как пятидесяти циклов деления вполне достаточно

424

Рис. 13-30. Демонстрация различий в наследуемой способности клеток к делению. Отдельные клетки в клоне, даже будучи генетически идентичными, различаются по числу циклов деления, которые они могут осуществить. Здесь представлены разные пары сестринских клеток из

одного исследованного клона, а также гистограммы, показывающие число клеток, проходящих то или иное число делений. Если одна из сестринских клеток не делится совсем, то другая обычно либо тоже не делится, либо проходит мало делений (слева); но если одна из сестринских клеток делится 8 и более раз, то другая обычно тоже претерпевает 8 и более делений (справа). Этот пример выявляет наследуемые различия между генетически идентичными клетками по числу циклов деления, которые они способны осуществить. Однако эти различные наследуемые состояния не вполне стабильны, так что иногда сестринские клетки ведут себя по-разному. Дальнейшие исследования показали, что по мере старения популяции в клетках происходят случайные переходы к пониженной способности делиться. (По данным J. R. Smith, R.G. Whitney, Science 207: 8284, 1980.)

для развития опухоли внушительных размеров. Еще одно предположение состоит в том, что старение клеток в весьма искусственных условиях клеточной культуры отражает тенденцию клеточной пролиферации в организме к постепенному замедлению с возрастом и что такое поведение клеток выработалось как способ стабилизации размеров взрослого организма.

Какова бы ни была функция клеточного старения, есть много данных о том, что на этот процесс сильно влияют факторы внеклеточной среды. Например, эпидермальные клетки из кожи ребенка стареют примерно после 50 циклов деления, если в среде отсутствует фактор роста эпидермиса, и после 150 циклов, если этот фактор имеется. «Бессмертные» клетки ЗТЗ проявляют признаки старения при недостатке факторов роста. Клетки от нормальных мышиных эмбрионов могут продолжать делиться бесконечно без малейших признаков старения, если их поместить в химическую среду определенного состава, содержащую вместо сыворотки набор очищенных факторов роста; добавление же сыворотки приводит к остановке пролиферации. Это позволяет предположить, что старение частично обусловлено какими-то компонентами сыворотки, которые тормозят пролиферацию клеток, перевешивая действие факторов роста.

Некоторые наследственные аномалии у человека, такие как синдром Вернера, приводят к преждевременному старению. Фибробласты, взятые от больных, обычно умирающих раньше 50 лет, в культуре перестают делиться после необычно малого числа митотических циклов. Интересно то, что эти фибробласты нечувствительны к PDGF и фактору роста фибробластов, но могут энергично делиться под действием других факторов роста.

Хотя в клеточной популяции при определенных условиях старение наступает в предсказуемое время, на уровне отдельной клетки оно не является жестко запрограммированным. В клоне по видимости идентичных нормальных фибробластов, растущих в стандартных условиях, одни клетки делятся многократно, тогда как другие - всего несколько раз. Индивидуальные клетки, по-видимому, перестают делиться в результате случайного перехода в иное состояние, вероятность которого возрастает в каждом последующем поколении клеток, пока не наступит момент, когда в популяции совсем не останется делящихся клеток (рис. 13-30).

Исследования на клеточных клонах показывают, что клетки, которые во всех других отношениях идентичны, различаются по способности к делению. Видимо, переход стареющей клетки в непролиферирующее состояние - это просто конечный результат ряда случайно распреде-

425

ленных во времени этапов ухудшения экспрессии генов, регулирующих готовность клеток проходить точку рестрикции. Молекулярная природа таких событий начинает проясняться благодаря исследованию раковых клеток, которые, помимо прочего, «бессмертны» и не подвержены старению.

Заключение

Клеточное деление у многоклеточных животных зависит от сложных «социальных» регуляторных механизмов, и пролиферация различных типов клеток контролируется различными сочетаниями белковых факторов роста. Они действуют в очень малых концентрациях, и многие из них служат локальными химическими медиаторами, позволяющими регулировать плотность клеточной популяции. Кроме того, большинство нормальных клеток неспособно делиться без прикрепления к внеклеточному матриксу. При недостатке факторов роста или при невозможности прикрепиться к матриксу клетки останавливаются после митоза, переходя в особое состояние покоя —G0 из которого после добавления факторов роста они могут выйти лишь через несколько часов. Когда клетка вышла из состояния G0 и прошла точку рестрикции в G1, она быстро проходит фазы S, G2 и М независимо от прикрепления или факторов роста. В пролиферирующей клеточной популяции переход через точку рестрикции представляет собой событие типа «всё или ничего», которое, подобно радиоактивному распаду, характеризуется определенной вероятностью осуществления. В дополнение к непосредственному контролю клеточной пролиферации существуют еще долговременные механизмы, приводящие к старению и прекращению деления нормальных соматических клеток млекопитающих в культуре после ограниченного числа циклов деления.

13.4. Гены «социального контроля» клеточного деления [26]

Как мы видели на примере дрожжей, генетика располагает большими возможностями для выяснения молекулярных основ регуляции клеточного деления, если имеются способы отбора мутаций соответствующих генов. У многоклеточных животных мутации генов, непосредственно участвующих в «социальном контроле» клеточного деления (мы будем называть их генами социального контроля), выделять нетрудно. Клетка, содержащая одну или несколько таких мутаций, будет продолжать делиться, игнорируя нужды организма как целого, и ее потомство образует макроскопически видимую опухоль.

Раковые опухоли - по определению злокачественные, т. е. их клетки не только делятся неконтролируемым образом, но и проникают в другие ткани, где появляются многочисленные вторичные опухоли, или метастазы. Для возникновения рака необходимо, чтобы в клетке сначала произошел ряд мутаций, освобождающих ее от воздействия различных регуляторов клеточного деления, а затем накопились дальнейшие изменения, делающие ее способной к инвазии и метастазированию. Эти аспекты рака будут обсуждаться в гл. 21. Здесь же мы не будем пытаться объяснить природу рака, а посмотрим, что можно узнать при изучении раковых клеток относительно тех генов, которые в норме контролируют клеточное деление.

427

Рис. 13-31. Раковые клетки в отличие от большинства нормальных клеток продолжают расти и наползают друг на друга, после того как образуют непрерывный монослой.

нередко обнаруживается целый комплекс аномалий (табл. 13-2): у них отсутствует контактное торможение клеточного деления (разд. 13.3.5) - вместо этого они наслаиваются друг на друга по мере роста культуры (рис. 13-31); для роста им часто не требуется прикрепление, и они способны делиться даже в суспензии; им свойственна более округленная форма, напоминающая форму нормальных клеток в митозе, и слабая адгезия к субстрату и друг к другу; они способны делиться даже в отсутствие факторов роста; они бессмертны и не подвержены старению в культуре; и наконец, если их инъецировать в организм подходящего хозяина, они могут давать начало опухолям.

13-20

13.4.2. Опухолеродные вирусы служат источником легко клонируемых онкогенов [28]

Опухолевый вирус разрушает нормальный контроль клеточного деления, необратимо изменяя генетическую конституцию клеткихозяина; в результате этого клетка начинает вырабатывать белок, не подверженный воздействию нормальных регуляторных механизмов. Поэтому такие вирусы дают возможность выявлять механизмы, ответственные в норме за контроль клеточного деления. До сих пор наиболее важные результаты были получены при изучении РНК-содержащих опухолевых вирусов, называемых также ретровирусами. После заражения клетки ретровирусом на его РНК путем обратной транскрипции синтезируется ДНК, которая затем включается в геном клетки-хозяина. Жизненный цикл ретровируса представлен на рис. 5-75.

Когда ретровирус трансформирует нормальную клетку в опухолевую, аномальное поведение часто бывает обусловлено геном, который ( привнесен вирусом, но для выживания и репродукции самого вируса фактически не нужен. Впервые это выяснилось, когда были открыты ' мутанты вируса саркомы Рауса, способные нормально размножаться, но не трансформирующие клетку. Оказалось, что некоторые из этих нетрансформирующих мутантов не имеют гена (или части гена), кодирующего белок с мол. массой 60000. В результате других мутаций этого гена трансформирующее действие вируса может становиться термочувствительным: зараженные клетки проявляют трансформированный фенотип при 34°С, но после повышения температуры до 39°С они быстро (через несколько часов) возвращаются к нормальному фенотипу (рис. 13-32). Повидимому, этот специфический ген в онкогенном вирусе ответствен за клеточную трансформацию (и этим привлекает наше внимание), но является ненужным балластом с точки зрения репродукции самого вируса.

Трансформирующий ген вируса саркомы Рауса, выявленный в этих

428

Рис. 13-32. Клетки, инфицированные вирусом саркомы Рауса, несущего термочувствительную мутацию гена, ответственного за трансформацию (онкогена v-src) (микрофотографии, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа). А. Клетки

трансформированы и приобрели аномальную округлую форму при низкой температуре (34 °С), при которой продукт онкогена активен. Б. Те же клетки, прочно прикрепленные к культуральной чашке и восстановившие свою нормальную уплощенную форму, после того как продукт онкогена инактивирован повышением температуры (до 39 °С). (С любезного разрешения G. Steven Martin.)

экспериментах, был назван геном v-src. Он был отнесен к онкогенам (от греч. onkos-масса, опухоль), так как при введении в нормальную клетку он превращает ее в опухолевую. Каково происхождение этого гена и какова его нормальная функция? Когда радиоактивная ДНК-копия вирусного гена src была использована как зонд для поиска родственных последовательностей методом ДНК-ДНК-гибридизации (разд. 4.6.7), оказалось, что геномы нормальных клеток позвоночных содержат очень сходную, но не идентичную последовательность. Этот гомолог вирусного гена src в нормальной клетке обозначают c-src и относят к протоонкогенам. По-видимому, вирусный онкоген был когда-то захвачен из генома клетки-хозяина и подвергся мутации. Можно предполагать, что протоонкоген - это один из нормальных генов социального конгроля, а ретровирус, по существу, клонировал его для нас. В настоящее время таким же способом выявлено и проанализировано много других онкогенов, и в каждом случае это привело к открытию соответствующего протоонкогена.

13-21

13.4.3. Опухоли, возникающие разными способами, содержат мутации одних и тех же протоонкогенов [26, 29]

Опухоли часто возникают не от вирусной инфекции, а в результате мутаций, происходящих случайно или же под действием химических канцерогенов или облучения. Из таких опухолевых клеток можно получить очищенную ДНК и проверить ее на наличие онкогенов путем введения в нетрансформированные клетки в культуре in vitro. Для такого теста часто используют клетки ЗТЗ, поскольку они неопределенно долго делятся в культуре и содержат мутации, благодаря которым их легко трансформировать добавлением всего лишь одного онкогена. Онкоген, ответственный за такую трансформацию, может быть выделен, клонирован и секвенирован с помощью метода рекомбинантной ДНК (рис. 13-33). Примечательно, что в большинстве случаев, когда это было сделано, онкоген оказывался мутантной формой одного из тех самых протоонкогенов, которые были выделены с использованием ретровируса, хотя при этом было открыто и несколько новых онкогенов.

При помощи сходных методов было установлено, что трансформация может также происходить в результате перепроизводства некоторых нормальных генных продуктов. Часто опухоли содержат неизмененный протоонкоген, избыточная экспрессия которого обуслов-