Molekuljarnaja Biologija Kletki v2

345

В табл. 12-1 приведены сведения о некоторых локальных химических медиаторах, нейромедиаторах и гормонах - указаны места их синтеза, структура и основное действие. Видно, что структура сигнальных молекул так же разнообразна, как и их функции. Среди этих молекул есть короткие пептиды, более крупные белки и гликопротеины, аминокислоты и родственные им соединения, стероиды (вещества, образующиеся из холестерола и очень сходные между собой по структуре) и производные жирных кислот. Каждая сигнальная молекула представлена в табл. 12-1 только в одном разделе, хотя многие из них могут действовать несколькими способами. Например, некоторые пептидные гормоны в головном мозгу позвоночных действуют как нейромедиаторы (в качестве паракринных факторов).

12.1.3. Разные клетки по-разному реагируют на один и тот же сигнал

Большинство клеток у взрослых животных специализировано для выполнения какой-то одной главной функции, и все они имеют характерный набор рецепторов, который позволяет им реагировать на химические сигналы, запускающие или модулирующие эту функцию. Многие сигнальные молекулы действуют в очень низкой концентрации (обычно не более 10-8 М), и связывающие их рецепторы, как правило, имеют к ним высокое сродство (константа сродства Ка ≥ 108 л/моль).

Одни и те же сигнальные молекулы часто оказывают различное действие на разные клетки-мишени. Например, ацетилхолин стимулирует сокращение волокон скелетной мускулатуры, но уменьшает частоту и силу сокращения клеток сердечной мышцы. В данном случае рецепторы ацетилхолина в скелетных мышцах отличаются от рецепторов на клетках миокарда. Но не всегда причина состоит в различии рецепторов. Часто одинаковые сигнальные молекулы связываются с идентичными рецепторами, и все же это ведет к совершенно разным реакциям у различных клеток-мишеней (рис. 12-5). Это означает, что ответы клеток-мишеней могут быть запрограммированы двумя способами: либо самим набором рецепторов клеточной поверхности, либо теми внутриклеточными системами, с которыми эти рецепторы сопряжены.

12.1.4. Реакция клетки на химический сигнал может быть в одних случаях быстрой и кратковременной, в других - медленной и продолжительной [2, 3]

Химические сигналы, приводящие клеточные функции в соответствие с изменениями среды, обычно вызывают быстрые и кратковременные ответы. Например, повышение уровня глюкозы в крови стимулирует секрецию белкового гормона инсулина эндокринными клетками поджелудочной железы. В считанные минуты повышение концентрации инсулина заставляет клетки печени и мышц усиленно поглощать глюкозу, и ее концентрация в крови падает. Этот ответ состоит из трех частей, ни одна их которых не требует синтеза нового белка:

1)в поджелудочной железе повышение уровня глюкозы заставляет клетки освобождать (путем экзоцитоза) запасенный в них инсулин;

2)в жировых и мышечных клетках во внутриклеточных пузырьках имеется некоторый резерв белков, транспортирующих глюкозу, и повышение уровня инсулина стимулирует включение этих пузырьков с их белками в плазматическую мембрану, что повышает скорость поглощения глюкозы; тогда уровень глюкозы в крови падает, и это снижает секрецию инсулина;

3)поскольку при снижении уровня инсулина добавочные переносчики

Рис. 12-5. Одни и те же сигнальные молекулы могут вызывать в разных клетках-мишенях различные ответы. В некоторых случаях это обусловлено тем, что сигнальная молекула связывается с разными белками-рецепторами (А и Б). В других случаях такие молекулы связываются с

одинаковыми рецепторами, но активируют в разных клетках разные механизмы ответа (В и Г).

346

глюкозы быстро удаляются с клеточной поверхности путем эндоцитоза и снова включаются во внутриклеточный пул, скорость поглощения глюкозы жировыми и мышечными клетками возвращается к исходному уровню. Таким способом поддерживается относительно постоянная концентрация глюкозы в крови.

Нейромедиаторы вызывают еще более быстрые реакции: в ответ на освобождение ацетилхолина из двигательных нервных окончаний волокна скелетной мышцы сокращаются и вновь расслабляются всего лишь за несколько миллисекунд.

Химические сигналы играют важную роль и в процессах индивидуального развития животных, нередко определяя время и тип дифференцировки тех или иных клеток. Некоторые из вызываемых эффектов проявляются медленно и бывают продолжительными. Например, в период полового созревания клетки яичника начинают секретировать в больших количествах стероидный женский половой гормон эстрадиол. Этот гормон вызывает изменение многих клеток в различных частях организма, что в конце концов приводит к развитию вторичных женских половых признаков, например к увеличению грудных желез. Если секреция эстрадиола прекращается, эти эффекты постепенно исчезают, но некоторые реакции, вызываемые стероидными половыми гормонами на очень ранней стадии развития млекопитающих, необратимы. Сходным образом, десятикратное повышение концентрации тиреоидного гормона в крови головастика стимулирует ряд радикальных и необратимых изменений, приводящих к его превращению в лягушку (рис. 12-6),

12.1.5. Только жирорастворимые сигнальные молекулы могут самостоятельно проникать в клетку

Все известные нейромедиаторы, а также большинство гормонов и локальных химических медиаторов водорастворимы. Есть, однако, исключения, и они образуют отдельный класс сигнальных молекул. Важными примерами служат сравнительно плохо растворимые в воде стероидные и тиреоидные гормоны, которые переносятся кровью в виде растворимых комплексов со специфическими белками-переносчиками. С таким различием в растворимости связаны фундаментальные различия в механизмах действия этих двух классов молекул на клетки-мишени. Водорастворимые молекулы слишком гидрофильны, чтобы прямо приходить через липидный бислой плазматической мембраны; поэтому они связываются со специфическими белковыми рецепторами на клеточной поверхности. Напротив, стероидные и тиреоидные гормоны растворимы в липидах и, отделившись от белка-носителя, могут легко проникать через плазматическую мембрану клетки-мишени. Эти гормоны связываются с белковыми рецепторами внутри клетки (рис. 12-7).

Еще одно важное различие между двумя описанными классами сигнальных молекул - это разная продолжительность жизни в кровотоке или тканевой жидкости. Водорастворимые молекулы, перейдя в кровь,

Рис. 12-6. Превращение головастика в лягушку. Показанные радикальные изменения вызываются тиреоидным гормоном. Если у развивающегося эмбриона удалить зачаток щитовидной железы, животное будет продолжать расти как головастик, не претерпевая метаморфоза.

При введении тиреоидного гормона этот гигантский головастик превращается в лягушку.

Рис. 12-7. Внеклеточные сигнальные молекулы в зависимости от своей растворимости связываются с поверхностными или внутриклеточными рецепторами. Гидрофильные молекулы не способны прямо проходить через плазматическую мембрану, поэтому они связываются с рецепторами на поверхности клетки-мишени. Многие гидрофобные молекулы могут диффундировать через плазматическую

мембрану и связываться с рецепторами внутри клетки. Будучи нерастворимы в водных средах, гидрофобные сигнальные молекулы транспортируются кровью в виде комплексов со специальными белками-переносчиками, от которых они отделяются, перед тем как проникнуть в клетку-мишень.

348

12.1.7. У млекопитающих клетки всех тканей непрерывно выделяют простагландины [5]

Для синтеза многих химических медиаторов существуют специальные клетки, но есть и такие медиаторы, источники которых более разнообразны. Важным примером служат простагландины - семейство производных жирной кислоты с 20 атомами углерода, образующихся во всех тканях млекопитающих. Эти локальные медиаторы непрерывно синтезируются в мембранах клеток из предшественников, отщепляемых от мембранных фосфолипидов фосфолипазами (рис. 12-8), и столь же непрерывно разрушаются ферментами во внеклеточной жидкости. Существует не менее 16 различных простагландинов, подразделяемых на 9 классов (PGA, PGB, PGC, ... PGI), которые, связываясь со специфическими рецепторами клеточной поверхности, вызывают разнообразные биологические эффекты.

В отличие от большинства других сигнальных молекул простагландины не накапливаются в клетках, а по мере их синтеза все время освобождаются во внеклеточное пространство. Однако, когда клетки активируются при повреждении ткани или под действием некоторых химических факторов, скорость синтеза простагландинов возрастает; повышение локальной концентрации простагландинов оказывает воздействие не только на клетку, которая их выделяет (аутокринная стимуляция), но и на соседние клетки. Аутокринная стимуляция, возникающая в ответ на другой химический сигнал, может усиливать эффект последнего и (или) его продолжительность, а также его распространение на большую локальную популяцию однотипных клеток.

С простагландинами связывают множество разнообразных биологических эффектов. Они вызывают сокращение гладкой мускулатуры, агрегацию тромбоцитов, участвуют в воспалительной реакции. Некото-

Рис. 12-8. Простагландины непрерывно синтезируются в мембранах из жирных кислот с длинной цепью, состоящих из 20 углеродных атомов и содержащих не менее трех двойных связей. На схеме показан синтез РОЕ2. Индекс указывает на две двойные углерод-углеродные связи

вне кольца PGE2. Простагландины вместе с химически родственными им сигнальными молекулами - тромбоксонами, лейкотриенами и липоксинами- образуются главным образом из арахидоновой кислоты и носят общее название эйкозаноидов. Этот метаболический путь служит важной мишенью для лекарственных препаратов, так как эйкозаноиды играют большую роль в развитии воспаления. Кортикостероидные гормоны, такие как кортизон, широко применяются при лечении неинфекционных воспалительных заболеваний, например некоторых форм артрита. Один из возможных механизмов их действия - индукция синтеза и (или) секреции лейкоцитами локальных химических медиаторов, называемых липокортшшми (или кальпактинами). Это белки, каким-то образом подавляющие активность фосфолипазы на первом этапе показанного здесь пути синтеза эйкозаноидов. Такие нестероидные противовоспалительные препараты, как аспирин, блокируют окислительные этапы синтеза простагландинов. Для лечения артритов применяют как кортикостероиды, так и аспирин.

349

рые простагландини, образующиеся в матке во время родов, по-видимому, важны для стимуляции сокращений гладкой мускулатуры матки. Эти простагландины сейчас широко используют в качестве фармакологических агентов, вызывающих аборт. С другой стороны, действие таких противовоспалительных средств, как аспирин, основано на подавлении биосинтеза прост аг лан динов в очагах воспаления.

Заключение

Внеклеточные сигнальные молекулы можно разделить по степени их «дальнодействия» на три основных класса: 1) локальные химические медиаторы, которые быстро поглощаются или разрушаются и поэтому оказывают влияние только на соседние клетки; 2) гормоны, которые переносятся к своим мишеням, распределенным нередко по всему организму, с кровотоком; 3) нейро медиаторы, действующие только на постсинаптическую клетку. Каждый тип клеток организма имеет свойственный ему набор белков-рецепторов, позволяющий запрограммированным и характерным образом реагировать на соответствующий набор сигнальных молекул.

Сигнальные молекулы можно также классифицировать по их растворимости в воде. Небольшие гидрофобные молекулы, такие как стероидные гормоны или гормоны щитовидной железы, свободно проходят через плазматическую мембрану клетки-мишени и активируют рецепторний белок в ее цитоплазме. В отличие от этого гидрофильные молекулы, в частности нейр о медиаторы и большинство гормонов и локальных химических медиаторов, активируют белковый рецептор на поверхности клетки-мишени.

12.2. Сигнализация с участием внутриклеточных рецепторов: механизмы действия стероидных гормонов

Множество онтогенетических и физиологических процессов у самых разных организмов - от грибов до человекарегулируется небольшим числом стероидных гормонов, синтезируемых из холестерола. Будучи сравнительно небольшими (мол. масса около 300) гидрофобными молекулами, эти гормоны проходят через плазматическую мембрану путем простой диффузии. Оказавшись внутри клетки-мишени, стероидный гормон каждого типа прочно, но обратимо связывается со своим специфическим рецепторным белком. Присоединение гормона ведет к аллостерическому изменению конформации рецепторного белка (процесс, называемый активацией рецептора}, что повышает сродство последнего к ДНК; это позволяет рецептору связываться со специфическими генами в ядре и регулировать их транскрипцию. Аналогичным образом действуют гормоны щитовидной железы (тиреоидные гормоны), связываясь со своими рецепторами, которые очень сходны с рецепторами стероидов.

12-10

12.2.1. Комплексы стероидных гормонов с рецепторами присоединяются к специфическим последовательностям ДНК и регулируют транскрипцию генов

Типичная клетка-мишень содержит около 10000 рецепторов для стероидных гормонов. Каждый рецептор может обратимо связать одну молекулу определенного гормона с высоким сродством (константа

350

Рис. 12-9. Модель белка-рецептора для стероидного гормона. Как полагают, в неактивном состоянии он связан с ингибиторным белком, который блокирует ДНК-связывающий домен рецептора. Связывание гормона рецептором приводит к отделению белка-ингибитора, и в результате

рецептор активируется. Прообразом для этой модели послужил рецептор кортизола (глюкокортикоида), но сходную структуру имеют также рецепторы для эстрогенов, тестостерона, прогестерона, альдостерона, тиреоид-ного гормона, ретиноевой кислоты и витамина D (см. рис. 10-25); вместе все эти белки образуют надсемейство рецепторов стероидных гормонов. В случае рецепторов кортизола и эстрогенов белком-ингибитором служит «белок теплового шока» hsp90 с мол. массой около 90000 (разд. 8.2.7).

сродства Ка от 108 до 1010 л/моль). Поскольку рецепторы составляют менее 0,01% общей массы белка в клетке, очистить и охарактеризовать их очень трудно. Недавно, однако, последовательности ДНК, кодирующие некоторые рецепторы стероидных гормонов позвоночных (их кДНК), были клонированы и секвенированы. Оказалось, что рецепторные белки имеют очень сходную структуру. Их полипептидная цепь длиной около 800 аминокислотных остатков образует три отдельных домена: С-концевой домен, который связывает гормон, центральный домен, связывающийся с ДНК, и N-концевой, который активирует транскрипцию гена (рис. 12-9).

Некоторые типы рецепторов стероидных гормонов изначально, в отсутствие гормона, находятся в цитозоле, а другие - в ядре. В обоих случаях присоединение гормона повышает сродство рецептора к ДНК, что позволяет рецептору прочно связываться с определенными нуклеотидными последовательностями в гене, который регулируется данным гормоном. Связывание гормон-рецепторного комплекса со специфическими участками гена активирует (или иногда подавляет) транскрипцию данного гена.

Получить прямое доказательство того, что активированные рецепторы стероидных гормонов связываются со специфическими генами, было очень трудно, и это удалось сделать лишь в 1983г., когда была разработана технология рекомбинантных ДНК. Она позволила клонировать гены, регулируемые стероидными гормонами, и получать в больших количествах специфические последовательности ДНК. Необходимо было еще очистить рецепторные белки, что само по себе является весьма трудоемкой и длительной процедурой. Как только удалось получить рецепторы в очищенном виде, связывающие их последовательности ДНК были картированы in vitro методом футпринтинга (разд. 4.6.6); оказалось, что присоединение рецептора защищает от мягкого расщепления нуклеазами или химическими реагентами группу специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. Если эти короткие узнаваемые последовательности из гена удалить, то стероидный гормон уже не будет активировать его транскрипцию. Более того, если короткий фрагмент ДНК, который содержит узнаваемую последовательность, слить с другим геном (репортером) и затем перенести в клетку, содержащую рецепторный белок, то соответствующий стероидный гормон будет активировать транскрипцию гена-репортера. Эти эксперименты показывают, что последовательности ДНК, узнаваемые in vitro активированными рецепторами стероидных гормонов, действительно опосредуют действие рецептора в клетке. Гены, чувствительные к стероидным гормонам, как правило, содержат несколько групп узнаваемых последовательностей, обычно расположенных «выше» (а иногда и «ниже») кодирующей области где-нибудь внутри гена (рис. 12-10). Ввиду значительной структурной гомологии между разнообразными рецепторами для стероидных гормонов близкое сходство распознаваемых ими последовательностей не вызывает удивления.

Однако под прямым влиянием стероидных гормонов находятся лишь немногие гены в любой клетке-мишени. Так, через 30 мин после добавления кортизола к культуре печеночных клеток крысы из тысячи белков, которые можно разделить методом двумерного гель-электрофо-

Рис. 12-10. Локализация последовательностей ДНК в том гене вируса молочной железы, который узнают активированные рецепторы кортизола. Каждая цветная полоска соответствует одному месту связывания рецептора (длиной 8 нуклеотидов). [По К.. R. Yamamoto. In: Transfer

and Expression of Eukaryotic Genes (H. Ginsbcig, H. J. Vogel, eds.), pp. 79-92. New York: Academic Press, 1984.]