Molekuljarnaja Biologija Kletki v2
.pdf
281
Своим АТР-зависимым головным участком мини-миозин связывается с актиновыми филаментами срединного пучка микроворсинки, а коротким хвостовым участком-с плазматической мембраной. Почему для образования такой связи используется «двигательный» белок, неизвестно; но, поскольку молекулы миозина движутся по актиновым филаментам в направлении к плюс-концу, следует ожидать, что в микроворсинке они должны тянуть компоненты мембраны к ее верхушке. Возможно, что такой механизм способствует непрерывному слущиванию плазматической мембраны с конца микроворсинки в просвет кишки, где связанные с мембраной пищеварительные ферменты продолжают свое действие.
О природе аморфной «шапочки» на кончике микроворсинки известно еще меньше. Как мы увидим, есть основания подозревать, что находящиеся в этой области белки контролируют толщину и длину пучка актиновых филаментов, определяя тем самым размеры микроворсинки (разд. 11.6.10). Если это так, то взаимодействие актиновых филаментов с плазматической мембраной микроворсинки на ее верхушке должно быть весьма сложным.
11.2.8. Благодаря фокальным контактам актиновые филаменты могут создавать тянущую силу, приложенную к субстрату [24]
Пучки актиновых филаментов часто присоединяются к плазматической мембране способом, который позволяет им передавать тянущее усилие на субстрат - будь то внеклеточный матрикс или другая клетка. Мы уже упоминали о таких способах прикрепления пучков актиновых филаментов у фибробластов и гладкомышечных клеток (разд. 11.14 и 11.17). В подобном соединении конца пучка с плазматической мембраной
участвуют трансмембранные линксрныс гликопротснпы. Лучше всего изучены места прикрепления культивируемых фибробластов к внеклеточному матриксу. Когда фибробласты растут в культуральной чашке, большая часть их обращенной к субстрату поверхности отделена от него промежутком более 50 нм. Однако в некоторых местах, называемых фокальными контактами или адгезионными пластинками, этот промежуток уменьшается до 10-15 нм. В отражательном интерференционном микроскопе, который собирает только свет, отраженный от нижней поверхности клетки, эти места имеют вид темных пятен. Окрасив клетку антителами к актину, можно показать, что именно здесь концы стрессовых волокон прикрепляются к плазматической мембране (рис. 11-37). В фокальном контакте клеточный кортекс соединяется при помощи
Рис. 11-37. Взаимоотношения междуфокальными контактами и стрессовыми волокнами в фибробласте invitro. Фокальные контакты лучше всего видны в живой клетке при использовании отражательной интерферснционной микроскопии (А). Свет при этом отражается от нижней
поверхности клетки, прикрепившейся к предметному стеклу, и фокальные контакты имеют вид темных пятнышек. На фото Б та же клетка окрашена (после фиксации) антителами к актину; видно, что большая часть пучков ее актиновых филамснтов (или стрессовых волокон)
оканчивается в фокальных контактах или в непосредственной близости от них. (С любезного разрешения Grenham Ireland.)
282
Рис. 11-38. Модель, показывающая, как трансмембранные линкерные гликопротеины плазматической мембраны могут соединять внутриклеточные актиновые филаменты с внеклеточным матриксом в фокальных контактах. Фокальные контакты образуются, когда связывание гликопротеинов матрикса с поверхностью клетки приводит к группировке трансмембранных линкеров в области контакта (А). Справа (Б) показано
возможное расположение внутриклеточных прикрепительных белков, осуществляющих связь между трансмембранными гликопротеинамилинкерами (например, рецептором фибронектина) и актиновыми филаментами.
трансмембранных белков-линкеров с компонентами внеклеточного матрикса (в частности, с фибронектином; см. разд. 14.2.13), которые адсорбированьт на чашке; Типичным1 трансмембранным линкером является рецептор фибронектина-построенный из двух цепей гликопротеин из группы интегринов (разд. 14.2.17). Его наружный домен связывается с фибронектином, а цитоплазматический соединен с актиновыми филаментами в стрессовых волокнах (рис. 11-38, А). Это соединение непрямое, в нем участвуют еще по меньшей мере четыре прикрепительных белка, в том числе талин и винкулин талин связывается как с цито-плазматическим доменом рецептора фибронектина, так и с винкулином. Ни один из этих белков, однако, прямо с актиновыми филаментами не соединен; по-видимому, с ними непосредственно связаны другие белки: белок, кэпирующий актиновые филаменты, который присоединяется к их плюс-концам, и α-актинин, который в мышцах прикреплен к актиновым, филаментам около плюс-конца в области Z-диска (разд. 11.1.13). Возможное расположение всех этих белков в фокальном контакте показано на рис.
11-38,Б.
С фокальными контактами весьма сходны места прикрепления акти-новых филаментов к плазматической мембране гладкомышечных клеток (разд. 11.1.14). Другая сходная (но уже в меньшей степени) структура-это опоясывающие десмосомы (адгезионные пояса), соединяющие эпителиальные клетки в пласты и позволяющие сократимым пучкам актиновых филаментов взаимодействовать через две смежные плазматические мембраны (разд. 14.1.3). В этих межклеточных контактах имеются винкулин и α-актинин, но нет талина, так что способ присоединения актиновых филаментов к плазматической мембране должен быть несколько иным, чем в фокальных контактах.
До сих пор мы обсуждали такие примеры прикрепления актиновых филаментов к мембране, где филаменты либо играют структурную роль (как в микроворсинках), либо способны передавать на мембрану тянущее усилие (как в фокальных контактах). В обоих этих случаях мы
283
Рис. 11-39. Кинетика полимеризании актина in vitro. Полимеризацию инициируют повышением ионной силы в растворе актина, и она обычно начинается после некоторой вдержки (лаг-фазы).
имеем дело с постоянными структурами - продуктами относительно стабильной ассоциации актиновых филаментов. Быстрые же изменения формы клеточной поверхности (например, при движении клетки) часто зависят от кратковременной регулируемой полимеризации актина. Но прежде чем рассматривать механизм быстрого выпячивания плазматической мембраны в результате полимеризации актина, мы сделаем краткое отступление и выясним, что известно о процессах такой полимеризации in vitro.
11-11
11.2.9. Рост актинового филамента происходит главным образом на плюс-конце [25]
Как уже упоминалось, in vitro молекулы актина могут спонтанно полимеризоваться в присутствии АТР, образуя филаменты. Обычно этот процесс инициируют повышением ионной силы раствора актина, а следить за его протеканием проще всего, измеряя увеличение светорассеяния раствора или флуоресценции ковалентне связанного красителя. Полимеризация актина развивается нелинейно - вначале наблюдается лаг-фаза, отражающая первую стадию, самую медленную и затрудненную, в которой три молекулы актина должны соединиться в определенной геометрической конфигурации (рис. 11-39). Эта стадия называется нуклеациеп. Когда нуклеация произошла, дальнейшее присоединение новых молекул актина к концам филамента происходит быстро. Процесс сборки филаментов обратим, и в конце концов концентрация мономеров падает до уровня, при котором скорости ассоциации и диссоциации мономеров становятся равными. Такую концентрацию называют критической. Если быстро разбавить раствор актина так, чтобы концентрация мономеров упала ниже критической, актиновые филаменты начнут распадаться, и их деполимеризация будет продолжаться до тех пор, пока не восстановится критическая концентрация мономеров. Как мы увидим, и нуклеация, и полимеризация актина в клетке находятся под контролем различных актин-связывающих белков, которые и определяют таким образом местоположение и длину актиновых филаментов. У полимеризации актина есть еще одна особенность, которая позволяет объяснить направленность роста филаментов при осуществле-
Рис. 11-40. Асимметричный рост актинового филамента. Если в качестве «затравки» для полимеризации актина использовать небольшие фрагменты актиновых нитей, помеченных головками миозина, можно увидеть, что сборка происходит гораздо быстрее на плюс-конце
первоначального фрагмента, чем на минус-конце. (С любезного разрешения M.S. Runge, Т. D. Pollard.)
284
нии различных клеточных движений. Как мы уже достаточно хорошо знаем, актиновые филаменты обладают полярностью, и важное следствие этой полярности - различная кинетика полимеризации плюс- и минус-концах. Это различие можно обнаружить, если пометить небольшой участок актинового филамента миозиновыми головками, а затем добавить к ним мономеры актина в условиях, благоприятных для полимеризации. Зафиксировав через некоторое время растущие актиновые филаменты, можно под электронным микроскопом увидеть, что их плюс-концы выросли гораздо больше, чем минус-концы (рис, 11-40). Проведя серию таких экспериментов, можно измерить скорость роста обоих концов филамента при различных концентрациях актиновых мономеров. В среде, соответствующей по ионному составу внутриклеточным условиям, очищенные актиновые филаменты растут на плюс-концах в 5-Ю раз быстрее, чем на минус-концах. По-видимому, in vivol рост почти всегда происходит на плюс-конце; поэтому, закрепив плюс-конец филамента в определенной ориентации, клетка может предопределить скорость и направление роста филамента.
11-12
11.2.10. В актиновых филаментах происходит «тредмиллинг» составляющих их субъединиц [25]
Эксперименты in vitro (вроде показанного на рис. 11-40) говорят о том, что концентрация актина, при которой рост филаментов прекращается, т. е. критическая концентрация, различна для разных концов филамента. Поэтому при полимеризации актина в пробирке достигается стационарное состояние, в котором присоединение мономеров происходит в основном на плюс-конце, а их отделение - на минус-конце. Скорости этих двух процессов в стационарном состоянии одинаковы, и потому концентрация свободных мономеров остается постоянной. Хотя общая длина полимера при этом не изменяется, отдельные молекулы актина непрерывно перемещаются от одного конца филамента к другому (рис. 11-41). Этот процесс, получивший название тредмиллинга, можно сравнить с продвижением людей в очереди.
Для тредмиллинга необходима энергия, иначе на его основе можно
Рис. 11-41. Скорость роста актиновых филаментов на разных концах при различных концентрациях мономеров актина. График показывает, что два конца растут с разными скоростями и критические концентрации для них различны. Поэтому существует некоторый диапазон
концентраций свободного актина (темная полоса), при которых плюс-конец актинового филамента полимеризуется, а минус-конец деполимеризуется. Когда in vitro свободный актин находится в равновесии с актиновыми филаментами, в целом роста не происходит, так как скорости отделения молекул от минус-конца и присоединения их к плюс-концу равны. При такой концентрации свободных актиновых субъединиц (промежуточной между критическими концентрациями для двух концов-показано цветной стрелкой) длина филаментов не изменяется, но молекулы актина в них все время движутся от одного конца полимера к другому. Этот процесс называют тредмил-лингом (см. схему 11-1).
285
Рис. 11-42. Ламеллоподии и микро-шипы на переднем крае человеческого фибробласта, передвигающегося в культуре (микрофотография, ученная с помощью сканирующего электронного микроскопа). Стрелкой указано направление движения. По мере того как клетка продвигается вперед, ламеллоподии и микрошипы перемещаются назад' по ее верхней стороне, что создает картину «раффлинга». (С
любезного разрешения Julian Heath.)
было бы создать вечный двигатель - машину, способную совершать работу, не расходуя энергии, т. е. нарушая законы термодинамики. В случае тредмиллинга энергию доставляет гидролиз АТР: каждый мономер актина связывает молекулу АТР, которую после своего присоединения к филаменту быстро гидролизует до ADP и фосфата. Каким образом гидролиз АТР делает возможным тредмиллинг, объясняется на схеме 11-1. Вскоре мы увидим (разд. 11.2.11), что тредмиллинг может быть одним из механизмов, с помощью которого актиновые нити и связанные с ними компоненты выполняют в клетке двигательные функции.
11.2.11. Многие клетки образуют на своей поверхности подвижные структуры, содержащие актин, - микрошипы и ламеллоподии [26]
Динамичные выступы клеточной поверхности с актиновыми филаментами внутри - весьма обычная черта животных клеток, особенно тех, которые в данный момент мигрируют или изменяют свою форму. Культивируемые клетки, например, часто образуют множество тонких жестких выростов толщиной около 0,1 мкм и длиной 5-10 мкм, называемых микрошипами, которые содержат рыхлые пучки примерно из 20 актиновых филаментов, ориентированных плюс-концами наружу. Растущий конец аксона нервной клетки-конус роста - выпускает еще более длинные микрошипы - филоподии, длина которых может достигать 50 мкм (разд. 19.7.7). Эти выступы клеточной поверхности весьма подвижны, они могут очень быстро появляться и исчезать. Видимо, они действуют подобно щупальцам, которыми клетка исследует окружающее пространство; те микрошипы, которые прочно прикрепляются к какому-то субстрату, направляют движущуюся клетку к этому более адгезивному участку, а те, которым прикрепиться не удалось, перемещаются .по верхней стороне клетки назад и там втягиваются.
Помимо микрошипов ползущие клетки и конусы роста периодически выбрасывают из своего активно продвигающегося («переднего») края тонкие пластинчатые отростки, получившие название ламеллоподии. Как и микрошипы, одни ламеллоподии успешно прикрепляются к субстрату,
286
СКОРОСТИ РОСТА НА ПЛЮС- И МИНУС-КОНЦАХ РАЗЛИЧНЫ Сборка (полимеризация) и разборка (деполимеризация) актиновых филаментов осуществляются путем присоединения и отделения
мономеров на концах филамента. В процессе сборки фипамент растет на одном из концов быстрее, чем на другом; быстро растущий конец называют плюс-концом, а медленно растущий - минус-концом. Различие в скоростях роста противоположных концов обусловлено тем, что каждая субъединица, присоединяясь к полимеру, изменяет свою конформацию.
Это конформационное изменение влияет на присоединение субъединицы преимущественно на одном из концов.
КРИТИЧЕСКАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ СУБЪЕДИНИЦ
Число субъединиц, присоединяющихся к полимеру за 1 с, пропорционально концентрации свободных субъединиц (kacc. [C] ) ; в то же время субъединицы диссоциируют от концов полимера с постоянной скоростью (kдисс ), от [ С ] не зависящей. По мере роста полимера свободные субъединицы расходуются и [С] снижается до тех пор, пока не достигает постоянной величины — критической концентрации (Сc), при которой скорость присоединения субъединиц к полимеру равна скорости их отделения от него. В этом состоянии равновесия
kасс. Сс = kдисс., откуда
И хотя значения kасс и kдисс для плюс- и минус-концов будут различны, их отношения kдисс/kасс значит и Сс, должны быть одинаковы на обоих концах. Это обусловлено тем, что при отделении субъединицы от любого конца полимера разрушаются совершенно одинаковые связи, а
конечные состояния субъединиц после этого тоже идентичны. Таким образом, изменение свободной энергии ДС при отделении субъединицы, определяющее константу равновесия для ассоциации субъединицы С концом (см. табл. 3-3), на обоих концах одно и то же; если плюс-конец растет вчетверо быстрее, чем минус-конец, то и укорачиваться он должен тоже вчетверо быстрее.
Итак, при [С] <С0 оба конца растут; при [С 1 > С0 оба конца укорачиваются (см. рис. 11 41)
ГИДРОЛИЗ АТР ПРИВОДИТ К ИЗМЕНЕНИЮ КОНСТАНТЫ РАСНОВЕСИЯ НА КАЖДОМ ИЗ КОНЦОВ Каждая молекула актина несет прочно связанную молекулу АТР. Вскоре после коформационного изменения субъединицы актина при ее
присоеди-нии к полимеру этот АТР гидролизуется до ADP. который остается прочно связанным с актином.
Гидролиз АТР уменьшает сродство субъединицы к соседним субъединицами и тем самым увеличивает вероятность ее отделения от
любого конца. Обычно присоединяется к филаменту форма 
, а покидает его форма 
(которая затем в растворе превращается в 
, так что процесс отделения субъединицы от полимера не является просто обращением реакции присоединения.
Расмотрим события, происходящие на плюс-конце:
Как и прежде, полимер будет расти, пока [ С ] не снизится до СС. Для большей наглядности мы можем Пренебречь величинами kасс и kдисс как малый; рост полимера прекратится при
kacc. CC = kдисс., т.е. С0 = kдисс./kасс. = 1/К
Это не истинное равновесие, а стационарное состояние, поскольку гидролизованный АТР должен быть восполнен путем обмена
нуклеотидов на свободной субъединице (
→
) ТРЕДМИЛЛИНГ
Так как kасс и kдисс относятся к различным реакциям, их отношение kдисс/kасс не обязательно будет одинаковым на разных концах полимера. Действительно, оказалось, что гидролиз АТР создает для противоположных концов различные критические концентрации, причем
Сс (для минус-конца) > сс (для плюс-конца).
Если оба конца полимера "открыты", полимеризация будет преобладать, пока [С] не достигнет некоторого уровня выше С для плюсконца и ниже Сс для минус-конца (см. рис. 11-14). В этом стационарном состоянии нз •плюс-конце будет идти сборка субьединиц в полимер, а на минус-конце — разборка полимера, причем скорости этих процессов будут одинаковы, так что длина полимера не будет изменяться, несмотря на перемещение субъединиц в полимере — тредмиллинг:
Для сборки филаментов гидролиз АТР не нужен. В подходящих условиях полимеризуются и мономеры актина, несущие негидролизуемый аналог АТР. Однако образующиеся при этом филаменты не способны к тредмиллингу - он возможен лишь благодаря гидролизу АТР, который сопутствует полимеризации.
287
Рис. 11-43. Актиновые филаменты в переднем крае культивируемого фибробласта. А. Электронная микрофотография цельного переднего края клетки, экстрагированной неионным детергентом для удаления плазматической мембраны и основной массы растворимых белков. Обратите внимание на ориентированную сетку актиновых филаментов в ламеллоподии, в которую погружен микрошип. Б. Схема расположения актиновых
филаментов ламеллоподии. (А-J.V. Small, J. Cell Biol. 91: 695-705, 1981. С разрешения Rockefeller University Press.)
другие же «соскальзывают» и в этом случае тоже волнообразно перемещаются назад по верхней поверхности клетки - этот процесс получил название «раффлинга» (ruffling-волнение, рябь) (рис. 11-42).
Ламеллоподию можно рассматривать как двумерный вариант микрошипа; на ее переднем крае нередко находится ряд коротких микрошипов. Если клетку осторожно зафиксировать и окрасить для электронной микроскопии, актиновые филаменты в ламеллоподиях двигавшейся клетки будут выглядеть гораздо более организованными, чем в других участках кортекса; упорядоченные группы филаментов вытянуты к переднему краю, где их плюс-концы упираются в плазматическую мембрану (рис. 11-43).
Исследование движущихся клеток в культуре показывает, что тредмиллинг мономеров в актиновых филаментах на переднем крае клетки идет гораздо быстрее, чем в филаментах, образованных in vitro. Движение молекул актина в клетке можно выявить в экспериментах с «гашением» флуоресценции. Если флуоресцентно меченные молекулы актина инъецировать в движущуюся клетку, они быстро включаются во все актиновые филаменты. Если теперь с помощью лазерного луча разрушить флуоресцирующую метку в небольшом пятнышке на тонком переднем крае клетки, то можно увидеть, как это темное пятнышко постепенно перемещается от края клетки внутрь со скоростью около 0,8 мкм/мин, что указывает на быстрый тредмиллинг молекул актина в филаментах ламеллоподии и микрошипов (рис. 11-44). Очевидно, мономеры актина все время присоединяются к плюс-концам у плазматической мембраны и отделяются от минус-концов в глубине клетки.
Если таким же образом погасить флуоресценцию актиновых филаментов на небольшом участке в любой другой области клетки, свечение через несколько минут восстановится без всякого видимого перемещения: очевидно, в организации или поведении актина в переднем крае клетки есть какие-то особенности. Было высказано предположение, что непрерывная полимеризация актина непосредственно под плазматической мембраной может использоваться для вытягивания переднего края клетки и помогать тем самым ее движению вперед (см. разд. 11.6.5). Изучение механизма перемещения спермиев некоторых беспозвоночных действительно показало участие в этом процессе полимеризации актина.
288
Рис. 11 -44. Тредмиллинг актина в культивируемых фибробластах. Флуоресцирующие молекулы актина были введены путем микроинъекции в клетку, где они включились в актиновые филаменты. Небольшое пятнышко на актиновом филаменте в переднем крае клетки
было «погашено» лучом лазера. Затем клетку фотографировали через определенные промежутки времени при помощи флуоресцентного микроскопа с видеоприставкой (разд. 4.1.6). Быстрое перемещение пригашенного пятна назад говорит о том, что молекулы актина непрерывно движутся по филаменту, удаляясь от переднего края.
11-13
11.2.12. Взрывообразная полимеризация актина способствует образованию акросомалыгого отростка у спермиев некоторых беспозвоночных [27]
Хотя появление многих выступов на клеточной поверхности, как полагают, зависит от полимеризации актиновых филаментов, о механизме запуска этого процесса мало что известно. Одно из исключений-акросомальная реакция у спермиев некоторых беспозвоночных (разд. 15.4.1). У спермия голотурии, например, область акросомы (в головке) «битком набита» неполимеризованным актином, связанным с небольшим белком профилином, которого довольно много в большинстве животных клеток. Профилин образует с молекулами актина эквимолярный комплекс и блокирует тем самым стадию нуклеации при самопроизвольной полимеризации актиновых филаментов, однако на рост плюс-концов уже имеющихся филаментов он значительного влияния не оказывает. Когда спермий вступает в контакт с наружной оболочкой яйцеклетки, рН его цитоплазмы возрастает и актин отделяется от профилина. Происходит взрывообразная полимеризация актина, благодаря которой быстро формируется одетый мембраной длинный и тонкий акросомалънып отросток, который, как гарпун, прокалывает оболочку яйца, позволяя мембранам яйца и спермия слиться (рис. 11-45). Кроме полимеризации актина вытягиванию акросомального отростка, видимо, способствует также поступление воды в головку спермия, создающее в ней гидростатическое давление.
Процесс образования акросомального отростка указывает на то, что полимеризация актина, вероятно, может вызывать быстрое выпячивание плазматической мембраны, не нарушая ее непрерывности. Хотя маловероятно, что ламеллоподии и микрошипы образуются за счет изменения доступного для полимеризации пула мономеров актина, все же выпячивание их, по-видимому, происходит точно так же - благодаря локальному росту актиновых филаментов у самой плазматической мембраны.
11.2.13. Сборка актина находится под контролем плазматической мембраны [28]
Клетка должна каким-то образом регулировать образование актинсодержащих выростов на своей поверхности, чтобы они появлялись только там, где нужно, и тогда, когда нужно. Например, макрофаг выпускает псевдоподии для захвата бактерии только в области контакта с ней (разд. 6.5.15), а полимеризация актина, помогающая выбросу акросомального отростка у активированного спермия голотурии, про-
289
Рнс. 11-45. Последовательные стадии удлинения акросомального отростка у спермия голотурии. Фотографии сделаны с помощью светового микроскопа, первая - через 2 с после искусственной стимуляции акросомальной реакции, остальные - с интервалами 0,75с. Дуга справа от
головки спермия - часть его изогнутого хвоста, попавшая в поле зрения. (L. G. Tilney, S, Inoufe, J. Cell Biol. 93: 820-827, 1982. С разрешения
Rockefeller University Press.)
исходит лишь тогда, когда головка спермия соприкасается со студенистым слоем на поверхности яйца.
«Время и место» для таких актин-зависимых ответов, по-видимому, регулируются путем контроля над участками нуклеации для роста актиновых филаментов около плазматической мембраны. В качестве иллюстрации можно взять хемотаксическую реакцию нейтрофилов. При местной бактериальной инфекции эти фагоцитирующие лейкоциты в больших количествах проникают сквозь стенки кровеносных капилляров и ползут сквозь ткани, пробираясь к очагу инфекции. К цели их направляют небольшие, свободно диффундирующие молекулы, которые высвобождаются в инфицированном участке. Процесс этот носит название хемотаксиса: клетки «чувствуют» градиент химического вещества и реагируют на него, изменяя направление своего движения. На поверхности нейтрофилов имеются белки-рецепторы, с помощью которых они могут обнаруживать очень низкие концентрации (~ 10-10 М) специфических хемоаттрактантов. При благоприятных условиях нейтрофилы способны воспринимать разницу концентраций пептида-хе-моаттрактанта на противоположных сторонах клетки всего лишь в 1 % и соответствующим образом переориентировать свой передний край, чтобы двигаться вверх по градиенту.
Некоторый свет на то, как связаны активация рецепторов и переориентация, пролили эксперименты, где изучали реакцию нейтрофилов на внезапное повышение концентрации пептида-хемоаттрактанта. Нейтрофилы при этом начинали выбрасывать микрошипы и ламеллоподии по всей своей поверхности, а доля полимеризованного актина в клетке за 20 секунд возрастала с 30 до 60%. Такая быстрая полимеризация актина происходила, вероятнее всего, благодаря увеличению числа участков нуклеации в плазматической мембране: когда такие обработанные хемоаттрактантом клетки подвергали лизису, лизат обладал повышенной способностью к нуклеации роста актиновых филаментов in vitro; кроме того, каждый активированный рецептор клеточной поверхности индуцировал рост значительного числа актиновых филаментов. К роли контролируемой полимеризации актина в направленной миграции клеток мы вернемся позже, когда будем рассматривать клеточную подвижность как интегрированный ответ целой клетки (разд. 11.6.3).
11.11.
11.2.14. Некоторые вещества влияют на поведение клеток, изменяя состояние полимеризации актина [29]
Можно было бы думать, что многие из производимых клеточным кортексом движений, как, например, фагоцитоз или локомоция, зависят от динамического равновесия между свободным (неполимерным) актином и актиновыми филаментами. Однако по сравнению со «взрывными» изменениями, происходящими в активированном спермин, изменения в полимеризации актина при этих движениях обычно слишком малы и краткоеременны, чтобы их легко было обнаружить. Однако на важную роль полимеризации и деполимеризации актина в таких движениях указывают эффекты ряда веществ, которые предотвращают изменения в состоянии актина и тем самым нарушают его двигательную функцию. Например, цитохалазины (рис. 11-46)-семейство метаболитов, выделяемых различными плесневыми грибами,-подавляют многие формы подвижности клеток позвоночных, включая локомоцию, фагоцитоз, цитокинез, образование ламеллоподии и микрошипов и сворачивание эпителиальных пластов в трубки. В то же время эти вещества не влияют на расхождение хромосом в митозе, которое зависит в основном от функции микротрубочек веретена, и на мышечное сокращение, в кото-
290
Рис. 11-46. Химическая структура цитохалазина В.
ром участвуют стабильные актиновые филаменты, не подвергающиеся сборке и разборке. Главная «точка приложения» для цитохалазинов - быстро растущие плюс-концы актиновых филаментов, с которыми цитохалазины специфически связываются и блокируют присоединение к ним новых мономеров актина.
Фаллоидин - высокотоксичный алкалоид бледной поганки (Атпіta phalloides) - в отличие от цитохалазинов стабилизирует актиновые филаменты, подавляя их деполимеризацию. Однако он очень плохо проникает сквозь плазматическую мембрану, и для того, чтобы он подействовал, его нужно вводить в клетку путем микроинъекции. При таком способе введения фаллоидин блокирует миграцию как амеб, так и культивируемых клеток позвоночных, что указывает на ключевую роль динамической сборки-разборки актиновых филаментов в этой форме подвижности. Так как фаллоидин специфически связываете именно с нитями актина, его флуоресцентные производные часто используют вместо антител к актину для выявления актиновых филаментов в клетке.
11.2.15. Свойства клеточного кортекса зависят от баланса кооперативных и конкурентных взаимодействий обширной группы актин-связывающих белков
Об актин-связывающих белках сейчас известно куда больше, чем о белках, взаимодействующих с двумя другими важными видами
нитчатых
Рис. 11-47. Некоторые главные классы актин-связывающих белков, имеющихся в большинстве клеток позвоночных.