1.6 Люмінесцентний метод

У певних умовах поглинена атомами речовини енергія може виділятися у вигляді променистої енергії. Так, розжарене тіло випускає промені певних довжин хвиль. Деякі речовини володіють здатністю світитися «холодним світлом», яке називається люмінесцентним. Люмінесцентне світіння може бути викликане дією різних видів енергії. Світіння речовини може відбуватися під впливом бомбардування його потоком електронів – катодними променями. Таке світіння називається катодолюмінісценцією; воно використовується в лампах денного світла. Світіння, зване триболюмінісценція, виникає при механічному руйнуванні кристалів речовини. Під впливом енергії хімічних реакцій може відбуватися світіння, зване хемілюмінесценція. Нарешті, світіння може бути викликане поглинанням променистої енергії – фотолюмінісценція.

По характеру люмінесцентного світіння розрізняють фосфоресценцію – світіння, що продовжується більш менш тривалий час після видалення джерела збудження світіння, і флуоресценцію – світіння, що припиняється відразу ж після видалення джерела збудження.

Всі ці види світіння, схожі за своєю природою, об'єднуються загальним поняттям люмінесценції.

Явище люмінесценції відоме дуже давно, проте детальне вивчення його починається тільки з кінця минулого сторіччя. Теорія люмінесцентного вивчення була дана на основі квантової теорії світла в 30-х роках XX століття. Практичне використання цього методу почалося ще пізніше, приблизно в 50-х роках.

Зі всіх типів люмінесценції для аналітичних цілей використовується головним чином явище флуоресценції, що викликається променистою енергією. Залежно від характеру процесів, що відбуваються у флуоресціюючій речовині, розрізняють два види світіння:

1) світіння дискретними центрами, що виникає тоді, коли поглинають і випромінюють променисту енергію одні і ті ж молекули (так флуоресціюють рідини і пари);

2) рекомбінаційне світіння, що виникає у тому випадку, коли в перетворенні енергії бере участь вся флуоресціююча речовина (таке свічення виникає у кристалів).

У фізико-хімічних методах аналізу використовують головним чином дискретне світіння розчинів.

Природа люмінесцентного випромінювання може бути розглянута на простій енергетичній моделі молекули. У молекулі разом з основними енергетичними рівнями , , існує ряд обертальних, таких, що коливають підрівнів , , , та інші (рисунок 1.13).

В процесі збудження електрон переходить на вищі рівні (І). Ці переходи супроводжуються поглинанням енергії, причому

.

(1.30)

Таким чином, перехід г вимагає поглинання променистої енергії коротших хвиль, ніж для переходу а або б.

Рисунок 1.13 – Рівні енергії і електронні переходи

Електрон, що знаходиться не на нульовому підрівні, може переходити на нульовий підрівень відповідного рівня (перехід д, рисунок 1.13). Ці переходи відповідають процесу коливальної дезактивації молекул і відбуваються під час зіткнень з молекулами інших речовин або розчинника і не супроводжуються випромінюванням променистої енергії.

До моменту початку люмінесцентного випромінювання майже всі збуджені електрони знаходяться на вищих енергетичних підрівнях. Перехід електронів на нульові підрівні може відбуватися різними шляхами. Електрон з вищого підрівня може безпосередньо повернутися на нульовий підрівень (перехід е і ж, рисунок 1.13). В цьому випадку енергія випромінювання рівна енергії збудження:

.

(1.31)

Звідси

.

(1.32)

Якщо електрон з вищого підрівня спочатку переходить на проміжний підрівень, що не супроводжується виділенням енергії, а потім переходить на підрівень (перехід з, рисунок 1.13), то в цьому випадку

(1.33)

і

.

(1.34)

Спектр випромінювання при цьому зрушується в бік більш довших хвиль. Таке положення спостерігається в більшості випадків "при випромінюванні спектрів поглинання і люмінесцентного випромінювання. Воно формулюється правилом Стокса – люмінесцентне випромінювання знаходиться в більш довгохвильовій частині спектру, чим поглинене світло.

Спектральні характеристики променів, збуджених люмінесценцію, і самій люмінесценції приведені на рисунок 1.14. В деяких випадках процес переходу електрона може відбуватися ступінчато, з рівня 2 на рівень 1 шляхом безвипромінювального переходу, а з рівня 1 на 0 у супроводі люмінесцентного випромінювання (перехід і, рисунок 1.13). В цьому випадку, як і раніше:

(1.35)

і

.

(1.36)

Іноді в результаті комбінування променевої енергії з тепловою переходи електронів можуть відбуватися ступінчато: з рівня на рівень за рахунок променевої енергії, потім з рівня на рівень за рахунок поглинання теплової енергії (перехід к, рисунок 1.13). В цьому випадку при зворотному переході з люмінесцентним випромінюванням (перехід л, рисунок 1.13) . Такі переходи називаються антистоксовими і вірогідність їх значно менше за стоксові переходи.

Рисунок 1.14 – Спектральні характеристики променів, збуджених люмінесценцію (а) і люмінесцентне випромінюваня (б)

Трохи інший механізм рекомбінаційного випромінювання кристалів. Електрони в кристалах можуть знаходитися в зоні валентності і в зоні провідності. Знаходження електрона в зоні провідності пов'язане з вільним його пересуванням в кристалі і обумовлює електропровідність кристала. Між цими зонами розташовується заборонена зона, в якій електрон знаходиться в нестабільному стані (рисунок 1.15). Ці зони можуть знаходитися на достатньо великій відстані один від одного, можуть перекриватися, як це має місце у металів.

Рисунок 1.15 – Рівні енергії та електронні переходи в кристалах

Електрон, що знаходиться всередині валентної зони, отримуючи квант променевої енергії, здатний переходити в зону провідності (перехід 1, рисунок 1.15). У валентній зоні при цьому утворюється «дірка», заряджена позитивно, яка може пересуватися в кристалі подібно до електрона. Збуджений електрон в зоні провідності за рахунок безвипромінювального переходу енергії переходить на стелю забороненої зони, такий же процес відбувається з «діркою», яка переходить на дно забороненої зони (переходи 2 і 3, рисунок 1.15). Тепер може відбутися процес заповнення електроном «дірки» (перехід 4, рисунок 1.15). Такий процес супроводжується випромінюванням кванта променевої енергії і називається процесом рекомбінації. Випромінювання це називається рекомбінаційним. В деяких випадках електрон і «дірка» можуть переходити в заборонену зону на рівні електронної і діркової пасток (переходи 5 і 6, рисунок 1.15). Між електроном і «діркою» на цих рівнях також може відбутися процес рекомбінації (перехід 7, рисунок 1.15). Процеси випромінювання 4 і 7 відбуваються в чистих кристалах і супроводжуються випромінюваннями з малими довжинами хвиль. Присутність в кристалах деяких домішок (активаторів) створює в забороненій зоні нові енергетичні рівні: нормальний і збуджений. На ці рівні можуть переходити як електрон, так і «дірка» (переходи 8 і 9, рисунок 1.15), в результаті може відбуватися рекомбінація електрона і «дірки» з випромінюванням енергії. Це випромінювання часто лежить в області видимого світла. Можуть відбуватися і інші процеси рекомбінації, наприклад електрона, що знаходиться на стелі забороненої зони, з «діркою», що знаходиться на нормальному рівні активатора (перехід 11, рисунок 1.15).

З численних типів люмінесценції найбільше значення має флуоресценція, яка характеризується 4 основними властивостями:

• спектром поглинання і флуоресценції;

• виходом флуоресценції;

• тривалістю флуоресценції;

• поляризацією флуоресцентного випромінювання.

На рисунок 1.16 приведені спектральні характеристики деяких органічних речовин. Такі спектральні характеристики, що дозволяють відрізняти одну флуоресціюючу речовину від іншого, використовуються для якісного флуоресцентного аналізу. Максимуму спектру відповідає колір флуоресціюючого випромінювання.

1 – стильбен; 2 – нафтол; 3 – дифенілоктатетраєн.

Рисунок 1.16 – Спектри флуоресценції деяких речовин

Якісне визначення природи флуоресціюючої речовини в простому випадку може бути проведене за кольором флуоресціюючого випромінювання. Наприклад, деякі алкалоїди флуоресціюють характерним для них кольором: кокаїн – світло-синім, кодеїн – слабо-жовтим, нікотин – темно-фіолетовим.

Таким чином, по забарвленню флуоресценції можна визначити присутність того або іншого алкалоїду в медичному препараті. По характеру флуоресценції можна розрізняти різні типи бітумів. Хлороформна витяжка володіє флуоресценцією; у легких бітумів – голубуватою або зеленуватою, легко зникаючою; у важких бітумів – яскраво-білою, такою, що поволі буріє до слабкою бурою або жовтою; у асфальтенів – білою, такою, що швидко буріє до слабкої темно-бурої, потім зникаючої.

Якісний флуоресцентний аналіз застосовують для визначення марок скла, сортів змащувальних масел, для дослідження мінералів і тому подібне Для кількісного спектрального аналізу використовують значення виходу флуоресценції В або пов'язану з ним інтенсивність флуоресцентного випромінювання – .

Розрізняють вихід флуоресценції енергетичний B_ен, рівний відношенню випромінюваної енергії Е_фл до поглиненої енергії Е_пог, і квантовий В_кв, рівний відношенню числа квантів флуоресценції N_фл до квантів поглиненої енергії N_пог. Між цими величинами існує співвідношення:

,

(1.37)

де і – середні довжини хвиль і частот відповідного енергетичного спектра.

Інтенсивність флуоресценції пропорційна числу квантів флуоресцентного випромінювання N_фл. Використовуючи виведені вище формули поглинання світлового потоку, приведені у фотометричному методі аналізу, можемо написати ряд співвідношень:

,

(1.38)

де К — коефіцієнт пропорційності;

і — інтенсивність світлових потоків.

Якщо величини і₀, В_кв є постійні, що можна досягти проведенням дослідів в стандартних умовах, то інтенсивність флуоресценції буде пропорційна концентрації флуоресціюючої речовини. Інтенсивність флуоресценції зазвичай вимірюють в умовних одиницях.

Прямолінійна залежність між інтенсивністю флуоресценції і концентрацією зберігається тільки при малих значеннях концентрації.

Інтенсивність флуоресцентного випромінювання визначається методами, вживаними в колориметричному і фотоколориметричному аналізах.

Вихід флуоресценції і інтенсивність флуоресцентного випромінювання залежать від ряду чинників.

При збудженні флуоресценції монохроматичним світлом вихід залежить від довжини хвилі збудженого світла. Ця залежність підкоряється наступному закону (С. І. Вавілов): при люмінесценції може зберегтися постійний квантовий вихід, якщо збудлива хвиля перетвориться в середньому в довшу. Навпаки, вихід люмінесценції різко зменшується при зворотному перетворенні довгих хвиль в коротші. Оскільки інтенсивність флуоресценції пропорційна не тільки квантовому виходу, але і молярному коефіцієнту поглинання, який також залежить від довжини хвилі, залежність її від довжини хвилі виходить складнішою.

При збільшенні довжини хвилі збудженого світла інтенсивність флуоресценції зростає до відомої межі, потім в деякому інтервалі хвиль залишається постійною, після чого при подальшому збільшенні довжини хвилі різко падає.

Крива залежності інтенсивності флуоресценції від довжини збудливого світла приведена на рисунок 1.17, а. Вид цієї кривої залежить від природи флуоресціюючої речовини. Зокрема, припинення флуоресценції (спадаюча гілка кривої) у різних речовин розташовується в різному інтервалі хвиль.

Рисунок 1.17 – Залежність інтенсивності флуоресценції: а – від довжини хвилі; б – від концентрації флуоресціюючої речовини

Для кількісного аналізу особливий інтерес представляє залежність інтенсивності флуоресценції від концентрації флуоресціюючої речовини. Характерна крива залежності інтенсивності флуоресценції від концентрації представлена на рисунок 1.17, б. В області малих концентрацій між інтенсивністю флуоресценції і концентрацією існує пряма пропорційність. Саме ця область і використовується для кількісного аналізу. Для більшості речовин ця область охоплює концентрації порядку 10^-7 – 10^-4 моль/л. Таким чином, флуоресцентний метод застосовний для визначення незначних кількостей речовин в розчинах. З підвищенням концентрації інтенсивність флуоресценції стає майже постійною, а потім різко падає. Це зменшення інтенсивності флуоресценції із збільшенням концентрації називається концентраційним гасінням флуоресценції. При концентраційному гасінні змінюється не тільки інтенсивність, але і спектр флуоресценції.

Явище концентраційного гасіння флуоресценції пояснюється декількома діями. При збільшенні концентрації відбувається зближення флуоресціюючих молекул. Це приводить до зміни їх енергетичних рівнів і збільшення кількості безвипромінювальних переходів. При зближенні молекул, навіть без зіткнення, виникає можливість резонансної взаємодії з передачею частини енергії. Це також приводить до втрати енергії і зменшення інтенсивності флуоресценції. Окрім цього, при зближенні молекул виникає можливість взаємодії їх між собою і з молекулами розчинника з утворенням складних асоціатів, що не володіють здатністю флуоресціювати.

Інтенсивність флуоресценції сильно залежить від температури. Підвищення температури приводить до зменшення інтенсивності флуоресценції (рисунок 1.18, а), це явище називається температурним гасінням флуоресценції. Очевидно, що флуоресцентний метод аналізу слід проводити тільки при невисоких температурах. Температурне гасіння флуоресценції пояснюється тим, що з підвищенням температури збільшується коливальна енергія молекул і зростає кількість безвипромінювальних переходів. До цього ж приводить можлива температурна дисоціація молекул. Проте в деяких випадках з підвищенням температури інтенсивність флуоресценції може зрости в результаті утворення нових модифікацій молекул, що володіють вищою здатністю флуоресціювати.

Рисунок 1.18 – Залежність виходу флуоресценції від температури (а) і рН (б)

Інтенсивність флуоресценції і її забарвлення залежать також від рН розчину. Загальних закономірностей для цієї залежності привести не можна. Для деяких флуоресціюючих речовин із збільшенням рН вихід флуоресценції падає (рисунок 1.18, б, крива 1). Для інших – підвищується (крива 2). Для флуоресцентних індикаторів флуоресценція виникає тільки в певному інтервалі значень рН (крива 3).

Для багатьох речовин із зміною реакції середовища змінюється і спектральна характеристика флуоресціюючої речовини (рисунок 1.19).

Рисунок 1.19 – Залежність спектральної характеристики флуоресценції від рН: 1 – кисле середовище; 2 – лужне середовище

У багатьох випадках інтенсивність флуоресценції залежить від присутності в розчині сторонніх речовин. Ряд речовин здатний гасити флуоресценцію, і в їх присутності інтенсивність її падає. Наприклад, бісульфіт натрію, тіосульфат натрію, перманганат калія та інші речовини здатні гасити флуоресценцію резоруфіна. Деякі речовини, навпаки, здатні викликати посилення флуоресценції. Так діють на флуоресценцію хініну добавки сульфатів.

Гасіння флуоресценції сторонніми речовинами може бути пов'язане як з хімічними, так і з фізичними процесами. При хімічному гасінні флуоресціююча молекула вступає у взаємодію із сторонньою речовиною, утворюючи нефлуоресціюючу сполуку. Одним з таких гасителів є кисень, при окисленні яким утворюються нефлуоресціюючий продукти. Тому часто при стоянні речовини на повітрі його флуоресценція поступово зменшується. В деяких випадках здатність ряду металів давати з флуоресціюючими органічними молекулами нефлуоресціюючі комплекси, тобто пригнічувати флуоресценцію огранічної речовини, використовується в аналітичних цілях для визначення цих металів.

а, в – спектральні характеристики флуоресціюючої і погасаючої речовини; б, г – гасіння флуоресценції залежно від концентрації погасаючої речовини.

Рисунок 1.20 – Гасіння флуоресценції

При фізичному гасінні флуоресценції відбувається передача частини енергії збудженої молекули в результаті безвипромінювальних переходів молекулам сторонньої речовини і зниження у зв'язку з цим інтенсивності флуоресценції. При цьому, залежно від спектру погасаючої речовини, можуть виникнути резонансні і нерезонансні гасіння. У тих випадках, коли спектри флуоресціюючої речовини і погасаючої речовини (рисунок 1.20, а) майже співпадають, відбувається сильне гасіння флуоресценції. Навіть невеликі добавки такої речовини різко знижують інтенсивність флуоресценції (рисунок 1.20, б). Якщо спектри погасаючої речовини і що флуоресціює сильно відрізняються один від одного (рисунок 1.20, в), то в цьому випадку обмін енергіями відбувається менш інтенсивно і вплив на інтенсивність флуоресценції значно менший (рисунок 1.20, г).

Гасіння сторонніми речовинами характеризується відношенням виходу флуоресценції без гасіння до виходу з гасінням В₀/В. Чим інтенсивніше гасіння, тим це відношення більше.

При проведенні флуоресцентних досліджень, особливо кількісних, необхідно стежити за вмістом в розчині сторонніх речовин, здатних змінювати інтенсивність флуоресценції.

Час флуоресценції розчину зазвичай дуже великий; флуоресценція зникає зразу ж після видалення джерела збудження.

Спектральні криві флуоресценції, яку називають поляризованим світлом, залежать від природи речовини, а іноді дають можливість достатньо чітко ідентифікувати речовини з близькими спектрами поглинання.

В складних випадках спектр поляризації флуоресценції часто дозволяє точніше ідентифікувати речовини.

Як і вихід флуоресценції, ступінь поляризації флуоресценції залежить від рН, температури, концентрації флуоресціюючої речовини. На відміну від виходу флуоресценції, який завжди падає із збільшенням температури, залежність ступеня поляризації флуоресценції від температури носить складніший характер і залежить ще і від концентрації.

Не дивлячись на те, що між ступенем поляризації флуоресценції і концентрацією, як і для виходу флуоресценції на певному інтервалі концентрацій, існує прямолінійна залежність, вона для аналітичних цілей використовується порівняно рідко. Практичного застосування поляризація флуоресценції поки ще не знайшла.

600 А, мм

600 Л, мм

UOO

Мал. VI-14. Спектри поляризації v поглинання флуоресценції флуоресцеїну(1) і родамина (2).

у вигляді люмінесцентного

В аналітичній хімії крім фотолюмінесцентних методів використовуються хемілюмінесцентні методи і, в першу чергу, хемілюмінесцентні індикатори. При хемілюмінесценції атом або молекула збуджуються за рахунок хімічної реакції, зазвичай окислення. Після цього збуджений атом, як це було описано вище, випромінює поглинену енергію свічення.

400

600

Л, нм

Мал. VI-1S. Спектральні криві кристалів сульфіду стронцію, активованих:

/ — міддю; 2 — марганцем; 3 — европием.

Викладені вище за закономірність в повній мірі відносяться до явища свічення кристалів – рекомбінаційного свічення. Характер свічення, тобто спектральна характеристика кристалів, залежить від природи домішок (активаторів). У певних умовах між інтенсивністю випромінювання і концентрацією активатора існує лінійна залежність (рисунок 1.21). Використання рекомбінаційного свічення в аналітичних цілях більш обмежене, ніж застосування флуоресценції в розчинах.

Рисунок 1.21 – Залежність інтенсивності флуоресценції від концентрації активатора

При проведенні кількісного флуоресцентного аналізу необхідно зважати на характер кривих поглинання самого флуоресціюючого розчину. Для ряду розчинів ці криві дзеркально симетричні. Залежно від природи речовини криві поглинання і флуоресценції можуть розташовуватися ізольовано або перекривати один одного (рисунок 1.22).

а – розчин антрацену в діоксані; б – лужний розчин флуоресцеїну.

Рисунок 1.22 – Спектральні криві поглинання (1) і флуоресценції (2) для деяких речовин

Флуоресцентний метод може бути використаний для прямого і непрямого аналізу. Прямі визначення ведуть безпосередньо по флуоресценції досліджуваного об'єкту. Необхідно відмітити, що серед неорганічних речовин дуже мало речовин, здатних флуоресціювати самостійно. До таких речовин належать сполуки урану і рідкоземельних елементів – церію, європію, самарії і інші. Значно частіше зустрічаються флуоресціюючі органічні речовини, наприклад резорцин, хінін, морфін і багато інших.

У непрямому флуоресцентному аналізі флуоресценція служить індикатором, який вказує закінчення процесу визначення даного іона або речовини. Флуоресцентні індикатори знаходять застосування майже у всіх методах об'ємного аналізу.

Флуоресцентні індикатори можуть бути застосовані і в методі окисно-відновного титрування внаслідок властивостей деяких речовин флуоресценціювати лише в окисній чи відновній формі. При титруванні сульфатом церію іонів заліза (II) у присутності силоксену флуоресценція розчину, навпаки, зникає після додавання надлишку окислювача. При окисно-відновних титруваннях застосовуються також хемілюмінесцентні індикатори. Наприклад, люмінол в лужному розчині не люмінесціює, а під впливом окислювачів – КМn0₄, К₂Cr₂O₇ і інших – виникає хемілюмінесценція окисленої форми продукту зеленого кольору. Особливо яскрава хемілюмінесценція виникає у присутності деяких каталізаторів. Оскільки виникнення хемілюмінесценції відбувається в певному інтервалі рН, ці індикатори можуть бути також використані для титрувань за методом нейтралізації.

Застосування адсорбційних флуоресцентних індикаторів в методі осадження значно підвищує точність визначення точки еквівалентності. Так, якщо до розчину нітрату срібла додати флуоресцин, виникає яскрава зелена флуоресценція. При додаванні до розчину невеликих кількостей хлориду флуоресценція зникає, оскільки флуоресцин адсорбується осадом хлориду срібла. Перші краплі розчину хлориду, додані після досягнення точки еквівалентності, викликають перезарядження частинок хлориду срібла, флуоресцин десорбується, і в розчині знову виникає яскрава флуоресценція.

В аргентометрії можуть бути застосовані флуоресцентні індикатори: еозин, родамін, флоксин та інші. У меркуриметрії можуть бути використані умбеліферон, хінінсульфат та інші.

У комплексонометричному титруванні використовуються флуоресцентні індикатори, що дають з визначуваним іоном флуоресціюючі сполуки, що руйнуються комплексоном. В цьому випадку в точці еквівалентності спостерігається гасіння флуоресценції. Так, флуорексон з іонами кальцію в лужному середовищі дає сполуку, що флуоресціює жовто-зеленим кольором. У міру скріплення іонів кальцію комплексоном флуоресценція слабшає і в точці еквівалентності зникає.

Флуоресцентні індикатори володіють рядом переваг в порівнянні із звичайними індикаторами. Перш за все, користуючись ними, можна титрувати непрозорі або забарвлені розчини. Ці індикатори для методу нейтралізації володіють вужчим, ніж інші індикатори, інтервалом переходу забарвлення, що у багатьох випадках буває дуже цінним.

Для непрямого флуоресцентного визначення може бути використане описане вище гасіння флуоресценції. В цьому випадку кінець титрування визначається по кривій ослаблення флуоресценції. На рисунку 1.23 приведена крива титрування флуоресціюючого цирконій-моринового комплексу іонами фтору. При цьому в результаті реакції

(1.39)

флуоресціюючий комплекс цирконію з морином перетворюється на нефлуоресціюючий комплекс цирконію з фтором і слабо флуоресціюючий залишок морина.

Рисунок 1.23 – Крива флуоресцентного титрування

Останнім часом в практиці флуоресцентного аналізу почали застосовуватися кристалофосфори. Як основа застосовуються CаO, CaS0₄, NаF та інші тугоплавкі сполуки. При додавання в ці сполуки активаторів (солей або оксидів заліза, талія та інших) і обробці нагріванням або опромінюванням ультрафіолетовими променями виникає фосфоресценція, інтенсивність якої пропорційна змісту активатора. Чутливість таких визначень для деяких іонів дуже велика. Правда, визначення з використанні кристалофосфорів вимагають значно більше часу, чим з використанням флуоресцентних реакцій, оскільки отримання кристалофосфорів пов'язане з дуже тонким подрібненням, перемішуванням і сплавом. Широкого застосування цей метод поки не знайшов.