- •П.А. Киселев, с.Б. Бокуть курс лекций по коллоидной химии
- •1. Коллоидная химия
- •1.1. Классификация коллоидных систем
- •1.2.Свойства коллоидных растворов
- •1.3. Методы приготовления коллоидных растворов
- •1.4. Оптические свойства и методы исследования коллоидных растворов
- •1.5.Рассеяние света (опалесценция)
- •1.6.Нефелометрия
- •1.7. Абсорбция (поглощение) света коллоидами и окраска коллоидных растворов
- •2. Молекулярно-кинетические свойства коллоидных растворов
- •2.1. Броуновское движение
- •2.2. Кинетическая устойчивость дисперсионных систем и седиментационное равновесие
- •2.3. Осмотическое давление
- •2.4. Равновесие Гиббса-Доннана
- •2.5. Электрические свойства коллоидных растворов. Электроосмос и электрофорез
- •2.6. Строение коллоидных частиц
- •3. Устойчивость дисперсных систем
- •3.1. Основные положения
- •3.2. Коагуляция гидрофобных коллоидов
- •3.3.Адсорбционно-сольватный барьер как фактор стабилизации коллоидных систем
- •3.4. Электрокинетический потенциал
- •3.5.Обратимость коагуляции. Пептизация
- •3.6. Студни и гели
- •4. Свойства растворов высокомолекулярных соединений
- •4.1. Набухание и растворение вмс
- •4.2. Термодинамические свойства растворов вмс
- •4.3. Вязкость растворов вмс
- •4.4. Растворы полимерных электролитов. Изоэлектрическая точка
- •5. Характеристика некоторых широко применяемых дисперсных систем
- •5.1. Общая характеристика эмульсий
- •5.2. Устойчивость эмульсий
- •5.3. Разрушение и обращение эмульсий
- •5.4. Пены
- •5.5. Суспензии
- •5.6. Аэрозоли
- •6. Характеристика некоторых спектральных методов исследования растворов вмс
- •6.1. Абсорбционная спектроскопия
- •6.2. Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора
- •6.3. Инфракрасная спектроскопия
- •6.4. Спектроскопия комбинационного рассеяния
- •6.5. Флуоресцентная спектроскопия
- •6.6. Изучение белков путем измерения их собственной флуоресценции
- •6.7. Поляризация флуоресценции
- •Содержание
6.6. Изучение белков путем измерения их собственной флуоресценции
При флуоресцентном анализе макромолекул используются два типа молекул флуоресцирующих хромофоров: собственные и внесенные. Здесь мы рассмотрим собственную флуоресценцию.
Белки содержат только три собственных флуорофора – остатки триптофана, тирозина и фенилаланина. На практике чаще всего пользуются флуоресценцией триптофана, потому что фенилаланин имеет очень низкий Q, а флуоресценция тирозина часто очень слаба из-за тушения. Флуоресценция тирозина почти полностью затушена, если он ионизован или расположен недалеко от аминогруппы, карбоксильной группы или триптофана. Ее можно обнаружить при возбуждении на 280 нм.
Основная цель изучения собственной флуоресценции белков – получение информации об их конформации. Возможность этого обусловлена тем, что флуоресценция триптофана, как и флуоресценция тирозина, существенно зависит от окружения (т.е. растворителя, рН, присутствия тушителя, других молекул или соседних групп в белке).
Эмпирические правила для интерпретации спектров флуоресценции белков
1. Вся флуоресценция белка обусловлена наличием остатков триптофана, тирозина и фенилаланина.
2. При уменьшении полярности растворителя махв спектре флуоресценции триптофана смещается в область более коротких волн, а интенсивность примахвозрастает.
3. Если вещества, известные как тушители, например иодид, нитрат или ионы цезия, тушат флуоресценцию триптофана или тирозина, то эти аминокислоты должны быть на поверхности белка. Если тушения не происходит, то это возможно по нескольким причинам:
аминокислота находится внутри молекулы;
аминокислота находится в полости, размеры которой слишком малы, чтобы туда вошел тушитель;
аминокислота в сильно заряженном участке, и заряд может отталкивать тушитель (если тушитель заряжен противоположно).
4. Если вещество, которое не влияет на квантовый выход свободной аминокислоты, действует на флуоресценцию белка, то это происходит за счет конформационных перестроек белка.
5. Если триптофан или тирозин находится в полярном окружении, характерные для них величины Qпонижаются при возрастании температуры, тогда как в неполярном окружении изменения величинQнезначительны.
6. Qтриптофана и тирозина понижается, если-карбоксильная группа этих аминокислот протонирована.
7. Флуоресценция триптофана тушится соседними протонодонорными группами. Следовательно, если рК измеренная путем контроля флуоресценции триптофана, такой же, как рК известной, способной к ионизации группы (например, имидазола гистидина), то эта группа должна находиться очень близко от триптофана.
8. Если при связывании какой-либо молекулы с белком тушится флуоресценция триптофана, то это либо происходит в результате конформационной перестройки белка, либо часть триптофановых участков находится в месте связывания или близко от него.
Конечно, все эти правила не дают абсолютной уверенности в правильности интерпретации, поскольку флуоресценция очень чувствительна к факторам окружения, тем не менее они очень полезны для предварительного получения информации, что должно быть дополнено получением данных другими независимыми методами.