- •П.А. Киселев, с.Б. Бокуть курс лекций по коллоидной химии
- •1. Коллоидная химия
- •1.1. Классификация коллоидных систем
- •1.2.Свойства коллоидных растворов
- •1.3. Методы приготовления коллоидных растворов
- •1.4. Оптические свойства и методы исследования коллоидных растворов
- •1.5.Рассеяние света (опалесценция)
- •1.6.Нефелометрия
- •1.7. Абсорбция (поглощение) света коллоидами и окраска коллоидных растворов
- •2. Молекулярно-кинетические свойства коллоидных растворов
- •2.1. Броуновское движение
- •2.2. Кинетическая устойчивость дисперсионных систем и седиментационное равновесие
- •2.3. Осмотическое давление
- •2.4. Равновесие Гиббса-Доннана
- •2.5. Электрические свойства коллоидных растворов. Электроосмос и электрофорез
- •2.6. Строение коллоидных частиц
- •3. Устойчивость дисперсных систем
- •3.1. Основные положения
- •3.2. Коагуляция гидрофобных коллоидов
- •3.3.Адсорбционно-сольватный барьер как фактор стабилизации коллоидных систем
- •3.4. Электрокинетический потенциал
- •3.5.Обратимость коагуляции. Пептизация
- •3.6. Студни и гели
- •4. Свойства растворов высокомолекулярных соединений
- •4.1. Набухание и растворение вмс
- •4.2. Термодинамические свойства растворов вмс
- •4.3. Вязкость растворов вмс
- •4.4. Растворы полимерных электролитов. Изоэлектрическая точка
- •5. Характеристика некоторых широко применяемых дисперсных систем
- •5.1. Общая характеристика эмульсий
- •5.2. Устойчивость эмульсий
- •5.3. Разрушение и обращение эмульсий
- •5.4. Пены
- •5.5. Суспензии
- •5.6. Аэрозоли
- •6. Характеристика некоторых спектральных методов исследования растворов вмс
- •6.1. Абсорбционная спектроскопия
- •6.2. Факторы, влияющие на абсорбционные свойства хромофора
- •6.3. Инфракрасная спектроскопия
- •6.4. Спектроскопия комбинационного рассеяния
- •6.5. Флуоресцентная спектроскопия
- •6.6. Изучение белков путем измерения их собственной флуоресценции
- •6.7. Поляризация флуоресценции
- •Содержание
6.5. Флуоресцентная спектроскопия
Как мы видели, спектры поглощения позволяют получать различного рода информацию о свойствах макромолекул и их взаимодействии с другими молекулами. Однако в случае некоторых молекул поглощение фотона сопровождается испусканием света с большей длиной волны (т.е. меньшей энергией). Испускание света называется флуоресценцией (или фосфоресценцией, если свечение долгоживущее). Спектры флуоресценции в еще большей степени, чем спектры поглощения, зависят от окружения. Для надежной регистрации параметров флуоресценции требуется меньшее количество вещества.
Путем измерения флуоресценции можно получить сведения о конформации макромолекул, местах связывания, взаимодействиях с растворителем, степени гибкости, межмолекулярных расстояниях, коэффициенте вращательной диффузии макромолекул. К тому же флуоресценцию можно использовать для локализации в живых клетках тех веществ, которые невозможно обнаружить другими методами.
Теория флуоресценции, как и других физических методов, пока еще не всегда позволяет провести однозначную корреляцию между флуоресцентными характеристиками и свойствами непосредственного окружения излучателя. Следовательно, и на этот раз возможность применения метода определяют эмпирические правила, полученные путем исследования модельных соединений.
Энергия света поглощается только в том случае, когда молекула переходит с нижнего на верхний энергетический уровень. Если молекула поглощает энергию большую, чем необходимо для того, чтобы достичь первого возбужденного состояния S1, то избыток энергии может возбудить колебания молекулярного остова, и молекула будет находиться на одном из колебательных уровней. Эта колебательная энергия быстро рассеивается в виде тепла путем соударения с молекулами растворителя, и молекула опускается на самый нижний возбужденный уровеньS1. Возбужденная молекула далее возвращается на уровеньS0, либо излучая свет (флуоресценция), либо путем безизлучательного перехода. Так как при переходе на самый нижний уровеньS1энергия теряется, испускаемый свет имеет меньшую энергию (т.е. большую длину волны), чем поглощенный свет. Однако, возвращаясь на уровеньS0, молекула вместо "абсолютного" основного состояния может попасть на один из колебательных уровнейS0. Эта колебательная энергия будет также рассеиваться в виде тепла.
Следовательно, если имеется много соответствующих подуровней, испускаемый свет будет иметь различные длины волн: форма спектра флуоресценции определяется набором (густотой) всех переходов с нижнего колебательного уровня первого возбужденного состояния на каждый колебательный уровень основного состояния. То есть спектры абсорбции характеризуют распределение колебательных уровней возбужденного состояния, а форма спектров флуоресценции – распределение подуровней в основном (невозбужденном) состоянии молекулы.
Возбужденная молекула не всегда флуоресцирует. Эффективность флуоресценции описывается квантовым выходом Q, а именно отношением числа излученных к числу поглощенных фотонов.Qопределяется несколькими факторами; одни из них связаны со свойствами самой молекулы (внутренние факторы), другие – со свойствами окружения. Внутренние факторы обуславливаются распределением колебательных уровней состоянииSoиS1. Например, если колебательный уровень основного состояния обладает той же самой энергией, что и колебательный уровень низкого порядкаS1, может иметь место безизлучательный переход сS1наS0, который сопровождается превращением энергии в тепло. Именно так обычно и происходит с гибкими молекулами, потому что для них характерны очень высокие колебательные уровниSo. Это является наиболее общим путем рассеяния энергии возбуждения, поэтому флуонофоры довольно редки и почти всегда являются жесткими ароматическими кольцами или системами колец.
При биологических исследованиях обычно большое значение имеют не внутренние факторы, а факторы окружения. За счет этих факторов происходит безизлучательный перенос или тушение флуоресценции. В биологических объектах тушение обычно является результатом либо столкновения (химреакции или просто столкновения с обменом энергии), либо безизлучательного дальнего переноса энергии, называемого резонансным переносом энергии.