5.2. Загальні тексти на біологічні продукт»

досліджувати на наявність мікроорганізмів. Крім того, можуть знадобитися дослідження з дисемінації штамів вакцин по тілу; особливу увагу слід приділити ділянкам схильним реплікувати організми. Ці дослідження обов'язкові для живих вакцин для профілактики широко відомих зоонозів тварин, використовуваних для виробництва продуктів харчування.

в) Посшення вірулентності. Використовують матеріал із рівня пасажу від головної посівної серії до кінцевого продукту, очікувано найбільш вірулентний для видів-мішеней. Використовувані тварини мають бути віку, який підходить для відновлення вірусу, і тварини в усіх групах у момент щеплення мають бути саме цього віку. Первинну вакцинацію проводять, використовуючи рекомендований шлях введення, що очікувано приводить до реверсії вірулентності. Після цього проводять не менше 5 подальших серійних пасажів через тварин видів-мішеней. Пасажі проводять шляхом введення, що найімовірніше веде до реверсії вірулентності. Якщо властивості вірусу дозволяють провести послідовні пасажі 5 групам через природне розповсюдження, може використовуватися цей метод, а інакше — проводять пасаж, як зазначено в кожній окремій статті. Той відновлений вірус, що пройшов максимальну кількість пасажів, тестують на посилення вірулентності. Використовують не менше 2 тварин для кожного пасажу. У кожному пасажі в матеріалі для пересівання показують наявність організмів—похідних живих вакцин. Безпеку матеріалу з найбільш вдалого пасажу порівнюють з безпекою непересіяного матеріалу.

Для деяких вірусів у окремій статті може бути зазначена необхідність проведення пасажів у більшої кількості тварин, якщо, виходячи з наявних даних, обгрунтовано, що це суттєво. Принаймні кінцевий пасаж проводять, використовуючи тварин найбільш підхожих для оцінювання ризику.

г) Біологічні властивості штамів вакцин. Для максимально точного визначення характерних біологічних властивостей штамів вакцин (наприклад, нейротропізм) може бути необхідне проведення додаткових випробувань. Для векторних вакцин проводять визначення ризику зміни тропізму або вірулентності штаму і, де необхідно, проводять специфічні випробування. Такі тести систематично проводять там, де продукт стороннього гена вводиться у штам як структурний білок.

д) Рекомбінація або геномнарекомбінація штаму. Слід розглянути можливість рекомбінації або гібридизації генома з польовими або іншими штамами.

В. ПОЛЬОВІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Результати лабораторних досліджень звичайно мають доповнюватися підтверджуючими польовими дослідженнями. Якщо є гарантія того, що лабораторними дослідженнями в експериментальних умо-

вах з використанням вакцин мінімального і максимального титру або активності відповідно адекватно оцінені безпека та ефективність продукту, то однією партією можна провести визначення як безпеки, так і ефективності продукту в польових умовах. У цих випадках може бути використана типова рутинна серія з середнім титром або активністю.

Для ссавців, використовуваних у харчовій промисловості, дослідження включають вимірювання температури тіла достатньої кількості тварин до і після приймання продукту; для інших ссавців вимірювання проводять, якщо лабораторні дослідження вказують на можливість виникнення проблеми. Записують розмір, стійкість будь-яких місцевих реакцій і кількість тварин, що проявляють місцеві або системні реакції*. Де можливо, проводять оцінку продуктивності.

Оцінка продуктивності бройлерів включає тижневу смертність, зміну співвідношення їжі, вік при забиванні та вагу, падіння і відхилення у виробничих технологіях. Для вакцин, використовуваних для несучок або птахів, що утримуються для відкладання яєць, відповідним чином вивчають дію вакцин на продуктивність відкладання і висиджування яєць.

С. ЕКОТОКСИЧНІСТЬ

Слід провести оцінку потенційно шкідливих ефектів продукту на навколишнє середовище і передбачити необхідні запобіжні заходи для зменшення таких ризиків. Ступінь Імовірного впливу продукту на навколишнє середовище слід оцінювати з урахуванням видів-мішеней і способу приймання; екскреції продукту і розміщення невикористаного продукту. Якщо ці фактори вказують на істотний вплив продукту на навколишнє середовище, визначають потенційну екотоксичність з урахуванням властивостей продукту.

5.2.7.ВИЗНАЧЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ВАКЦИН ТА ІМУНОСИРОВАТОК ДЛЯ ЗАСТОСУВАННЯ У ВЕТЕРИНАРІЇ

У тексті статті термін «продукт» означає або вакцину, або імуносироватку.

При розробці продукту проводять випробування, що демонструють ефективність продукту при введенні кожним шляхом і методом, що рекомендуються, використовуючи рекомендовану схему для кожного виду і категорії тварин, яким пропонується застосування продукту. Тип випробування ефективності, яке проводиться, значно варіюється залежно від особливостей продукту.

Як частину здійснюваних випробувань при розробці для встановлення ефективності можна проводити випробування, наведене в розділі ^Виробництво», з урахуванням наведеного нижче.

Використовувана доза — та кількість продукту, яка рекомендується до застосування і містить мінімальний титр або активність, очікувані в кінці терміну придатності.

Для живих вакцин використовують партію вакцини, що містить вірус/бактерії найбільш атенуйованого рівня пасажу, присутнього в партії вакцини.

Для імуносироваток, де застосовно, випробовувана доза також має містити мінімальні кількості імуноглобуліну або гама-глобуліну і/або загального білка.

Усі наведені свідчення мають підтверджуватися доказами з ефективності. Наприклад, якщо зазначено, що продукт має захисну дію від респіраторних захворювань, то цю здатність як мінімум слід довести захистом від клінічних ознак респіраторних захворювань. Де зазначена захисна реакція від інфекцій, це слід продемонструвати методом повторного виділення. При заяві більш однієї здатності слід підтвердити кожну з них.

Вакцини. Адекватно визначають дію пасивно набутих або материнських антитіл на ефективність вакцин. Будь-які зазначення, встановлені або такі, що маються на увазі, відносно початку та тривалості захисної реакції мають підтверджуватися одержаними результатами досліджень.

Зазначення щодо тривалості імунітету підтримуються доказом захисту. Не обов'язкове використання моделі випробування, наведеної у розділах «Імуногенність» і/або «Активність», для підтримки зазначення щодо тривалості імунітету, викликаного вакциною.

Використовуючи комбіновані вакцини, слід підтвердити ефективність кожного компонента мультивалентних і комбінованих вакцин.

Імуносироватки. Особливу увагу слід приділити забезпеченню підтверджуючими даними ефективності рекомендованого режиму застосування. Наприклад, якщо рекомендується використовувати імуносироватку один раз для досягнення профілактичного або терапевтичного ефекту, то це слід підтвердити. Будь-які твердження, встановлені або такі, що маються на увазі, відносно початку та тривалості захисної реакції або терапевтичного ефекту мають підтверджуватися одержаними результатами досліджень. Наприклад, слід вивчити тривалість захисного ефекту після приймання профілактичної дози протисироватки для наведення відповідної вказівки на етикетці або в інструкції щодо застосування.

Проводять дослідження з імунологічної сумісності імуносироваток, якщо рекомендується одночасне їх застосування або вони застосовуються як частина звичайного графіка приймання. Там, де продукт рекомендується як частина схеми приймання, показують початковий або підсилюючий ефекти або внесок продукту в ефективність схеми в цілому.

5.2.Загальні тексти на біологічні продукт»

ЛАБОРАТОРНІ ВИПРОБУВАННЯ

Взагалі, підтвердження ефективності проводять у добре контрольованих лабораторних умовах провокаційним зараженням тварин-мішеней рекомендованими способами застосування.

Провокаційне зараження слід проводити в умовах максимально наближених до природних умов інфікування, наприклад з урахуванням кількості заражених організмів і шляхів зараження.

Вакцини. Якшо немає інших зазначень, провокаційне зараження проводять зі штамом, який відрізняється від того, що використовується при виробництві вакцин.

Якщо можливо, слід визначити імунний механізм (клітини-посередники /гуморальне, місцеве/загальне, класи імуноглобулінів), який запускається в організмі тварин-мішеней при застосуванні вакцин.

Імуносироватки. Отримують результати, вимірюючи рівень антитіл, що утворилися після приймання продукту рекоменованим способом видами-мішенями. Якщо є відповідні літературні дані про гарантовано високий рівень захисних антитіл, провокаційне зараження можна не проводити.

Якщо необхідні провокаційні зараження, їх можна провести до або після приймання продукту відповідно до зазначень і встановлених специфічних показників.

ПОЛЬОВІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Результати лабораторних досліджень звичайно мають доповнюватися підтверджуючими польовими дослідженнями, проведеними, якщо немає інших зазначень, на контрольних тваринах, які раніше не пройшли лікування. Якщо є гарантія того, що лабораторними дослідженнями в експериментальних умовах, використовуючи вакцини мінімального і максимального титру або активності відповідно, адекватно оцінені безпека та ефективність продукту, то однією партією можна провести визначення як безпеки, так і ефективності продукту в польових умовах. У цих випадках, де застосовно, може бути використана типова рутинна партія з середнім титром або активністю. Там, де лабораторні дослідження не можуть підтвердити ефективність, допускається подання тільки результатів польових досліджень.

5.2.9.ВИЗНАЧЕННЯ БЕЗПЕКИ КОЖНОЇ ПАРТІЇ ВАКЦИН ІМУНОСИРОВАТОК ДЛЯ ЗАСТОСУВАННЯ У ВЕТЕРИНАРІЇ

У тексті статті термін vпродукт» означає або вакцину, або імуносироватку.

Визначений аномальних реакцій. У ході досд ідженьіз розробки продукту у світлі випробувань з оеапеки

5.2. Загальні тексти на біологічні продукт»

визначають тип і ступіньреакцій. очікуваних ПІСЛЯ приймання продукту. Ці визначення нормальних або аномальних місцевих і системних реакцій потім використовують якчастину робочої процедури з оцінки безпеки кожної партії на прийнятні та неприйнятні реакції.

Кількість, що застосовується у випробуванні. У випробуваннях «доза* означає кількість продукту, яка рекомендується до застосування і містить максимальний титр або активність у межах, зазначених для виробничих партій. Кількість, шо застосовується у випробуванні, звичайно зазначають кількістю доз. Для ліофілізованих вакцин 10 доз розчиняють у підхожому об'ємі для випробування. Для продуктів, шо складаються з контейнера ліофілізованого компонента (компонентів) і контейнера інактивованого компонента (компонентів). використовуваного як розчинник, може бути необхідне використання ще й іншої рідини для розчинення ліофілізованого компонента (компонентів). Вміст двох контейнерів інактивованого компонента, змішаний із вмістом максимальної кількості контейнерів із ліофілізованими живими компонентами, вводять в одну ділянку, а в іншу, якщо зазначено та обгрунтовано, вводять живі ліофілізовані компоненти, розчинені в підхожому розчиннику. Для комбінованих вакцин випробування з безпеки, проведені на комбінованих вакцинах, вважаються достатніми для підтвердження безпеки індивідуальних компонентів.

Шляхи введення. Продукт застосовують рекомендованим шляхом введення. У принципі, перевагу слід надавати шляху введення, що дає найбільшу можливість визначити реакції.

Якщо, наприклад, із досліджень з розробки відомо про особливий ризик, проводиться друге приймання, використовуючи відповідну дозу і через часовий інтервал, визначений при розробці.

Види тварин-мішеней і категорії тварин. Для вакцинації або приймання продукту використовують тварин мінімального віку й найбільш чутливих видів, якщо немає інших зазначень.

Кількість тварин. Використовувану для випробування кількість тварин зазначають в окремій статті. Звичайно для видів ссавців використовують двох тварин і 10 птахів або риб.

Ідентифікація тварин. Якщо немає інших зазначень, усі тварини маркуються відповідним способом для забезпечення індивідуальної документації результатів протягом усього періоду спостереження.

Період спостереження. Там, де необхідно записувати такий об'єктивний критерій, як температура тіла, тварин оглядають і обстежують протягом не менше трьохдіб до приймання продукту. Після приймання продукту тварин оглядають і обстежують не рід-

ше одного разу на добу протягом не менше 14 діб на наявність ознак місцевих і системнихреакцій, У день приймання продукту необхідно провести ще одну додаткову інспекцію через 4 год або інтервал, зазначений в окремій статті. Там. де приписане друге приймання продукту, період спостереження закінчується звичайно через 14 діб після другого приймання.

Місцеві та системні реакції. Тварин, шо виявляють аномальні місцеві або системні реакції, усипляють. Проводять post-mortem макроскопічне дослідження всіх тварин. Може бути зазначена необхідність проведення додаткових мікроскопічних і мікробіологічних досліджень.

Тварин оглядають і обстежують на наявність ознак місцевих! системних реакцій. Якщо відомі корисні індикатори, наприклад температура, масатіла, інші показники продуктивності та споживання їжі. записують ці критерії.

Місцеві реакції. Там. де можливо і необхідно, записують розмір і персистенцію будь-яких місцевих реакцій (включаючи частоту хворобливих реакцій) і співвідношення тварин, шо проявляють місцеві реакції.

Системні реакції. Звичайно як індикатор системної дії приймання продукту записують температуру та, якщо необхідно, масу тіла. Додатково реєструють усі клінічні симптоми.

Температура тіла. Для ссавців протягом періоду спостереження вимірюють температуру тіла. Реєстрацію вимірювань температури тіла починають не менше як за три доби до приймання продукту, у момент приймання, через 4 год і далі через відповідні інтервали. Температура тіла до приймання продукту має бути у фізіологічних межах норми. Якщо передбачається, що приймання продукту може викликати значне підвищення температури (наприклад, продукти, що містять ендотоксини або низку живих вірусних вакцин) або це зазначено в окремій статті (наприклад, підвищення температури не більше ніж на 2 °С для вакцин свинячого актинобацильозу), для відправної точки розробки випробування рекомендується за базову лінію температури тіла брати середнє значення температур діб, передуючих прийманню (наприклад, від -3 до 0 доби).

Маса тіла та споживання їжі. Якщо це є вірогідним і корисним індикатором безпеки, наприклад для молодих зростаючих тварин або риб, вимірюють і реєструють масу тіла незадовго перед прийманням і протягом періоду спостереження. Як індикатор дії приймання продукту контролюють і документують споживання їжі. У більшості випадків досить записати денний раціон витрати або часткову або повну відмову від їжі. але в деяких випадках, коли це значущий індикатор безпеки, може бути необхідно записувати фактичну вагу спожитої їжі.

Клінічні ознаки. Записують усі очікувані або несподівані клінічні ознаки загального характеру, включаючи зміни стану здоров'я або поведінки.

Протокол досліджень. Для кожного продукту заповнюють протокол досліджень у світлі очікуваних симптомів. Усі параметри та дані заносять до протоколу. Протоколи містять загальні параметри, а також перелік найбільш явних клінічних симптомів, характерних для даного продукту.

Критерії повторення випробування. Якщо зареєстрований аномальний симптом, відповідальний

ветеринар, якщо необхідно, на основі post-mortem дослідження визначає, чи с це наслідком приймання продукту чи ні. Якщо ие зрозуміла причина аномального симптому або падіж тварин не пов'язаний із прийманням продукту, випробування можна повторити. Якщо «другому випробуванні спостерігається аналогічно першому випробуванню аномальний еимптом, продукт не витримує випробування. Реєструється будь-яке лікування тварин у період спостереження. Якщо лікування може вплинути на результати досліджень, проведене випробування вважається невірогідним.

5.6.КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ІНТЕРФЕРОНІВ

Дана стаття мас інформаційний характер.

1. ВСТУП

Монографії з інтерферонів людини звичайно містять біологічний метод кількісного визначення, який заснований на здатності інтерферону інгібувати цитопатичну дію вірусу на клітинну лінію в культурі. Проте в більшості випадків не зазначають вірус, клітинну лінію і деталі визначення, що забезпечує відповідну гнучкість, коли стаття описує більш як один підклас інтерферонів.

Ця стаття наведена, щоб надати інформацію з планування, оптимізації та валідації кількісних визначень інтерферонів для відповідної комбінації клітинної лінії і вірусу, що має цитопатичний ефект. Як приклад підхожого методу наведений детальний опис конкретного зразка антивірусного визначення, а також інформація про інші комбінації вірус-клітина та керівництво з адаптації та валідації методик для них.

2. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИВІРУСНОЇ АКТИВНОСТІ (ІНГІБУВАННЯ ЦИТОПАТИЧНОГО ЕФЕКТУ)

Кількісне визначення антивірусної активності інтерферону людини засноване на індукції відповіді в клітинах людини, яка запобігає або знижує цитопатичний ефект інфекційного вірусу. Активність інтерферону визначають, порівнюючи його захисну дію проти цитопатичного ефекту вірусу з такою самою дією стандартного препарату, каліброваного в Міжнародних одиницях.

3. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ІНТЕРФЕРОНУ З ВИКОРИСТАННЯМ КЛІТИН НЕР2с І ВІРУСУ ІНФЕКЦІЙНОГО ЕНЦЕФАЛОМІОКАРДИТУ

Наведенний метод кількісного визначення інтерферонів людини належить до одного з типів зменшення цитопатичного ефекту. Для вимірювання активності різних випробовуваних препаратів інтерферонів людини використовують клітини людини Нер2с, інфіковані вірусом енцефаломіокардиту (EMCV). Це кількісне визначення вже було використане Всесвітньою Організацією Охорони Здоров'я (ВООЗ) у трьох міжнародних міжлабораторних визначеннях кандидата в Міжнародні стандарти для альфа-, бета- і гама-інтерферонів людини, і була неодноразово продемонстрована чутливість, надійність і відтворюваність методу при визначенні активності інтерферонів людин різних типів.

5.6. Кількісне визначення інтерферонів

Усі процедури з культурами клітин ссавців виконують із використанням стандартних методів культивування таких ліній клітин. Зазначені об'єми реактивів наведені для культивування клітин у 75 см2 флаконах. Можна використовувати інші типи контейнерів (флакони або чашки), але при цьому слід відповідно змінити об'єми реактивів.

3.1. ВИРОЩУВАННЯ І ПІДГОТОВКА КЛІТИН НЕР2с

Клітини Нер2с підтримують і пересівають у середовищі для культивування А.

Клітини зберігають у замороженому вигляді згідно зі стандартними операційними процедурами. Зростаючі клітини можуть утримуватися в культурі протягом дозволеної кількісті пасажів — ЗО, після чого закладають нові культури із замороженого запасу.

На початку дослідження збирають клітини з флаконів із 90 % суцільним моношаром, застосувавши метод обробки трипсином, наведений нижче.

— З флаконів видаляють середовище для культивування.

—До кожного флакона додають по 5 мл розчину трипсину, нагрітого до температури 37 °С (початковий розчин трипсину містить 4 мг/мл трипсину Рї 4 мг/мл натрію едетату Р, безпосередньо перед застосуванням розчин розводять у 50 разів фосфатним забуференим сольовим розчином). У закупорених флаконах обертальними рухами змочують моношар клітин. Видаляють надлишок розчину трипсину.

— Інкубують флакони протягом від 5 хв до 10 хв при температурі 37 °С. Під мікроскопом або візуально досліджують клітини на наявність ознак відкріплення від скла. При дослідженні під мікроскопом клітини мають бути закругленими або відкріпленими від скла та вільно плаваючими. Енергійно струшують флакон для відшаровування всіх клітин і додають близько 5 мл середовища для культивування А. Енергійно струшують флакон до отримання суспензії окремих клітин.

—Для приготування клітинних суспензій для процедур кількісного визначення обережно диспергують клітини піпетуванням вгору-вниз для руйнування агрегатів клітин, підраховують кількість клітин і ресуспендують "їх до концентрації 6 х 10s клітин/мл.

3.2. КУЛЬТИВУВАННЯ ВІРУСУ ЕНЦЕФАЛОМІОКАРДИТУ

Вірус енцефаломіокардиту розмножують у клітинах L-929 мишей для створення запасу потомства вірусу. Клітини L-929 культивуютьзадопомогоютрипсинізації і пасажу, як зазначено для клітин Нер2с (ПРИМІТКА: у разі поганогоросту клітин може виникнути необхідність заміни сироватки піе.іячоїнеоната.іьноі на сироватку бичачу ембріональну).

5.6. Кількісне визначення інтерферонів

Бер\ть декілька флаконів із суцільним моношаром клітин L-929. Видаляють із флаконів середовище. Інокулюють 2 мл суспензії EMCV, відповідним чином розведеної середовищем для культивування В, так, щоб вийшло близько 2.5 х 10s бляшкоутворюючих одиниць (БУО (PTF)) ка мілілітр. Оскільки кожен флакон містить 4-6 х 10? клітин L-929, множинність інфекції (м.і., т.о.і.)) складатиме близько 10 БУО/клітину. Обережно обертальними рухами розподіляють вірусну суспензію по всьому моношарі клітин і флакони витримують в інкубаторі протягом близько 1 год. рН середовища підтримують на рівні від 7.4 до 7.S.

Після адсорбції ЕМСУдо кожного флакона додають по 40 мл середовища для культивування В і флакони інкубують при температурі 37 °С протягом 30 год. рН середовища підтримують на рівні від 7.4 до 7.8 для отримання максимального виходу вірусу. Культуральну рідину збирають і зберігають при температурі близько 4 °С.

Флакони витримують при температурі —20 °С для заморожування моношару клітин. Потім розморожують їх при кімнатній температурі. Додають близько 5 мл середовища для культивування і струшують флакони для руйнування клітинних стінок. Вміст кожного флакона переносять у контейнер із культуральною рідиною. Отриману культуральну рідину, що містить EMCV, переносять у центрифужні пробірки місткістю 50 мл і центрифугують при 500 g протягом близько 10 хв для видалення уламків клітин. Очищену культуральну рідину розливають у скляні флакони з кришками, що закручуються, по 20 мл, 10 мл, 5 мл, 1 мл, 0.5 мл або 0.2 мл, відповідно, і зберігають при температурі —70 °С.'Якщо необхідно, великі об'єми можна розморожувати, розливати меншими порціями і повторно заморожувати. EMCV зберігає свій початковий титр, якщо постійно зберігається при температурі близько —70 °С, але повторні цикли заморожування-розморожування або зберігання при вищій температурі, наприклад —20 °С, призводять до швидкого падіння титру.

3.3. МЕТОДИКА КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ

3.3.1. Визначення діапазону доза-відповідь

Приготування розчинів

Відповідний стандартний препарат інтерферону (наприклад, специфічний субтип стандартного препарату інтерферону ВООЗ) розводять у середовищі для культивування А з індексом розведення 10 для отримання доз, що покривають діапазон 1000-0.001 МО/мл. Випробування проводять у 96-лунковому мікропланшеті, У кожну лунку додають по 100 мкл середовища дитя культивування А, по 100 мкл кожного розведення стандартного препарату в усі лунки, крім тих лунок, які призначені для контролю вірусу. Перемішують вміст кожноїлунки мікропланшета, використовуючи багатоканальну піпетку, виставлену на 100 мкл.

Роз.іив клітинної суспензії

Суспензію клітин Нер2с, що містить близько 6 х 10" клітин в 1 мл середовища для культивування А, розливають у пластикову чашку Петрі. За допомогою багатоканальної піпетки, виставленої на 100 мкл, переносять по 100 мкл цієї суспензії в кожну лунку мікропланшета.

Планшети інкубують протягом 24 год при температурі 37 °Сі5%СО,.

Зараження вірусом

На цій стадії, використовуючи інверсійний мікроскоп, перевіряють стан клітин Нер2с: моношар має бути суцільним, клітини мають бути відносно однорідно розподілені, повинні мати правильну морфологію і бути здоровими.

Видаляють більшу частину середовища з лунок, перевернувши планшет і витрусивши його вміст на паперову серветку (так само чинять для видалення рідини з мікропланшета, як зазначено далі). Початковій EMCV розводять свіжим середовищем для культивування А до титру близько 3 х 107 БУО/мл

(ПРИМІТКА: для кожної чашки необхідно близько 20мл розведеного вірусу, плюс від 5% до 10% додаткового об'єму). Розведену клітинну суспензію з 9 см стерильної чашки Петрі розливають по 200 мкл багатоканальною піпеткою, виставленою на 200 мкл, у всі лунки, включаючи лунки контролю вірусу, окрім лунок контролю клітин. У кожну лунку контролю клітин додають по 200 мкл середовища для культивування А без вірусу.

Планшети витримують в інкубаторі близько 24 год при температурі 37 °С і 5 % CO,.

Забарвлення

Під мікроскопом досліджують планшети для оцінки цитопатичного ефекту (ц.п.е.) EMCV у контролях вірусу. Час розвитку максимального ц.п.е. може варіюватися від одного визначення до іншого через властиву клітинам Нер2с мінливість реакції на зараження вірусом у кожний певний період безперервного культивування.

Зливають середовище для культивування з лунок у підхожий деконтамінуючий розчин (за підхожий вважається розчин натрію гіпохлориду). У кожну лунку додають фосфатний забуферений саіьовийрозчин рН 7.4. Потім зливають його в деконтамінуючий розчин. У кожну лунку додають по 150 мкл забарвлюючого розчину і залишають планшет на близько 30 хв при кімнатній температурі. Зливають забарвлюючий розчин у деконтамінуючий розчин. У кожну лунку додають по 150 мкл фіксуючого розчину і витримують протягом 10 хв при кімнатній температурі. Зливають фіксуючий розчин у деконтамінуючий розчин. Промивають моношар клітин, занурюючи планшети в пластикову коробку з проточною водою. Зливають воду та висушують поверхню планшетів за допомогою паперових рушників. Планшети вису-

шукягь при температурі вія 20 °С до 37 °С до повного випаровування вологи.

У кожну лунку додають по 150 мкл 0.1 М розчину натрію гідроксиду. Барвник елюють обережним обертанням планшета або легким постукуванням об долото руки. Перед визначенням спектрофотометрією слід упевнитися, шо барвник рівномірно розподілений в лунках.

Використовуючи спектрофотометр для вимірювання абсорбції у мікропланшетах, вимірюють абсорбцію за довжини хвилі від 610 нм до 620 нм, використовуючи як холосту пробу лунку або ряд лунок без клітин, шо містять 150 мкл 0.1Мрозчину натрію гідроксиду.

Визначають концентрації стандартного препарату інтерферону, що спричиняють максимальне і мінімальне зниження цитопатичного ефекту. Це доза-відповідь, яка відповідає робочому діапазону визначення.

3.3.2. Методика кількісного визначення

Проводять визначення, наведене вище, використовуючи:

—як розчини для випробування випробовувану субстанцію, розведену середовищем для культивування А (фактор розведення 2), для отримання номінальних концентрацій, що покривають робочий діапазон визначення;

—як стандартні розчини відповідний стандартний препарат інтерферону (наприклад, специфічний субтип інтерферону ВООЗ), розведений середовищем для культивування А (з індексом розведення 2), для отримання номінальних концентрацій, що покривають робочий діапазон визначення.

3.3.3.Аналіз результатів

5.6. Кількісне визначення інтерферонів

ліній клітин і вірусів, наприклад: EMCV використовували в комбінації з лінією епітеліальних клітин карциноми легені А549; вірус Semliki Forest або Sindbis використовували з людськими фібробластами; вірус стоматиту везикули використовували або з людськими диплощними фібробластами, лінією клітин амніона людини WISH, або лінією клітин нирки бика Madin-Darby. Кожного разу вибір комбінації клітинна лінія/вірус звичайно базується на тому, яка з них найбільш чутлива до випробовуваного препарату інтерферону й аналогічно відповідає при порівнянні випробовуваного препарату зі стандартним.

4.2. ВИБІР РЕАКЦІЇ

Методика забарвлення, наведена вище, дозволяє визначати кількість життєздатних клітин. Використовують низку інших реакцій, зокрема методику забарвлення метил-фіолетовим або кристалічним фіолетовим або методику конверсії тіазоліл блакитного (МТТ). Кожного разу метод вибирають на основі отримання відповідних лінійних і чутливих взаємозв'язків між кольором реакції і числом життєздатних клітин.

4.3. СТАТИСТИЧНА ВАЛІДАЦІЯ

Як і для всіх інших біологічних визначень за моделлю паралельних ліній, визначення має задовольняти звичайні статистичні критерії лінійності відповіді, паралельності та варіабельності.

4.4. ВАЛІДАЦІЯ ФОРМАТУ ВИЗНА ЧЕННЯ

Результати визначення зниження цитопатичних ефектів звичайно вкладаються в сигмоїдальну криву доза-відповідь при побудові графіка залежності концентрації інтерферону (log еквівалентного розведення інтерферону) від абсорбції барвника.

Будують графік залежності концентрації інтерферону (log еквівалентного розведення інтерферону) від абсорбції барвника для розчинів стандартного препарату інтерферону і випробовуваного препарату. За лінійною частиною кривої розраховують концентрацію інтерферону в зразку, порівнюючи результати для випробовуваних і стандартних розчинів, використовуючи звичайні статистичні методи визначення паралельних ліній.

4.ВАЛІДАЦІЯ ІНШИХ МЕТОДИК

4.1.ВИБІР КЛІТИННИХ ЛІНІЙ І ВІРУСІВ

Для визначення антивірусної активності інтерферонів використовувалися багато інших комбінацій

Як і для всіх методик із використанням мікропланшетів, слід приділити особливу увагу валідації формату кількісного визначення. Особливо слід вивчити і виключити систематичну помилку через нерандомізований порядок піпетування або крайові ефекти планшетів. Для цього слід проводити рандомізацію формату визначення або не використовувати крайні лунки.

РЕАКТИВИ ТА СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ