При приготуванні живильного середовища замість ферментативного гідролізату біомаси мікроорганізмів без оболонок може бути використаний панкреатичний гідролізат м'яса (за Хоттінгером) глибокого розщеплення. Середовище має містити від ЗО мг% до 35 мг% амінного азоту.

Значення рН середовища після стерилізації має становити від 7.8 до 8.0.

При приготуванні живильного середовища замість ферментативного гідролізату біомаси мікроорганізмів без оболонок може бути використаний панкреатичний гідролізат м'яса (за Хоттінгером) глибокого розщеплення. Середовище має містити від ЗО мг% до 35 мг% амінного азоту.

Значення рН середовища після стерилізації має становити від 5.8 до 6.0.

Значення рН середовища після стерилізації має становити від 7.8 до 8.0.

Значення рН середовища після стерилізації має становити 6.8 до 7.0.

При приготуванні живильного середовища замість ферментативного гідролізату біомаси мікроорганізмів без оболонок може бути використаний панкреатичний гідролізат м'яса (за Хоттінгером) глибокого розщеплення. Середовище має містити від 130 мг% до 140 мг% амінного азоту.

При приготуванні живильних середовищ на основі сухого ферментативного гідролізату мікроорганізмів без оболонок інгредієнти складу вносять у воду очищену, додають замочений заздалегідь агар і нагрівають до повного його розплавлення. Установлюють рН таким чином, щоб після стерилізації його значення становило величину, зазначену вище для кожного живильного середовища, і у Таблиці 2.7.2.-4. При необхідності фільтрують крізь марлевий фільтр. Стерилізують у паровому стерилізаторі при температурі 121 °С протягом 15 хв.

Примітка: Кількість агару у живильних середовищах зазначена для випробування з використанням циліндрів. При проведенні випробування з використанням лунок кількість агару збільшують до 20-25 г. Допускається зміна кількості агару в середовищах у залежності від його якості.

2.7.5. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ГЕПАРИНУ

Антикоагулянтну активність гепарину визначають in vitro шляхом порівняння його здатності у заданих умовах затримувати згортання рекальцинованої цитратної овечої плазми крові з аналогічною здатністю стандартного препарату гепарину, каліброваного у Міжнародних одиницях (МО).

МО — активність, що міститься у зазначеній кількості міжнародного стандарту, що складається з певної кількості ліофілізованої натрієвої солі гепарину, отриманої зі слизових оболонок кишечника свиней. Еквівалент МО міжнародного стандартного препарату встановлює Всесвітня Організація Охорони Здоров'я.

ВСТІгепарину натрію, у МО, калібрують відповідно міжнародного стандарту із використанням одного з наведених нижче методів кількісного визначення.

Кількісне визначення виконують одним із таких методів встановлення початку згортання. Для визначення використовують пробірки та інше обладнання, відповідно до вибраного методу:

—візуальне спостереження, переважно у відбитому світлі на чорному матовому тлі;

—спектрофотометрична реєстрація зміни оптичної густини за довжини хвилі близько 600 нм;

—візуальна фіксація зміни плинності шляхом обережного нахилу пробірок (проводиться вручну);

—механічний запис зміни плинності, що визначається при перемішуванні, із дотриманням запобіжних засобів, спрямованих на мінімізацію збурювання розчину на початковій стадії згортання.

МЕТОДИКА КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ

Наведені в тексті об'єми є прикладом, і за умови дотримання співвідношень між різними об'ємами

можуть бути адаптовані до апаратури, шо використовується.

БСГ1 гепарину натрію розводять розчином 9 r/л натріюхюриду Рдо отримання точно відомої кількості МО у мілілітрі, аналогічно готують розчин випробовуваного препарату, для якого передбачена така сама активність. Із кожного одержаного розчину готують ряд розведень у геометричній прогресії, використовуючи розчин 9 г/л натрію хюриду P. так. щоб час згортання для нижчої концентрації не менше ніж в 1.5 рази перевищував час згортання у рекальцинованій плазмі, а час згортання для вищої концентрації мав значення, що дають можливість побудувати задовільну криву «доза-ефект». Крива •ьдоза-ефект» визначається в ході попереднього випробування.

Поміщають дванадцять пробірок у льодяну баню. Позначаютьїх таким чином: два ряди (Т,, Т, і Т3) для розведень випробовуваного препарату та два ряди (S„ S2 і S5) для розведень стандартного препарату. У кожну із пробірок додають 1.0 мл розмороженої піазми субстрату Р1та 1.0 мл відповідних розведень випробовуваного або стандартного препаратів.

Після кожного додавання розчин перемішують, не допускаючи утворення бульбашок. Для подальших маніпуляцій пробірки відбирають у такому поряд-

ку: Sl5 S2, S3, Т, Т2, Т3. Кожну із пробірок поміщають у водяну баню, нагріту до температури 37 °С,

та відстоюють протягом 15 хв. Додають до кожної з пробірок 1.0 мл підхожого активатора часткового тромбопластинового часу (АРТТ), що містить фосфоліпід та контактний активатор, у такому співвідношенні, щоб тривалість рекальцифікації плазми не перевищувала 60 с. Рівно через 2 хв додають 1.0 мл попередньо нагрітого до 37 °С розчину 3.7 г/л кальцію хлориду Р. Реєструють як час згортання інтервал, у секундах, між останнім додаванням розчину та початком згортання, що визначають за допомогою обраноїтехніки. Аналогічним чином визначають час згортання на початку та наприкінці випробування, використовуючи замість одного з розведень гепарину 1.0 мл розчину 9 г/л натрію хлориду Р. Два одержаних значення не мають істотно відрізнятися. Час згортання переводять у логарифми; для пробірок, що дублюються, використовують середні значення. Процедуру повторюють із свіжими розведеннями, проводячи інкубацію у такому порядку: Ті, Т2, ТЗ, SI, S2, S3. Результати обчислюють із використанням звичайних статистичних методів.

Проводять не менше трьох незалежних визначень. Для кожного визначення готують свіжі розчини стандартного та випробовуваного препаратів і використовують нову свіжорозморожену порцію плазми субстрату Р1.

Активність випробовуваного препарату обчислюють шляхом об'єднання результатів усіх визначень з використанням звичайних статистичних методів.

Якщо відхилення, викликане відмінностями між результатами визначень, є значущим при Р = 0.01,

125

об'єднана оцінка активності може бути отримана шляхом обчислення незважених середніх значень оцінок активності.

2.7.6.КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ВАКЦИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ДИФТЕРІЇ (АДСОРБОВАНОЇ)

Активність вакцини для профілактики дифтерії визначають введенням вакцини мурчакам після їх провокаційного зараження дифтерійним токсином (метод А або В) або визначенням титру антитіл до дифтерійного токсину або анатоксину в сироватці мурчаків (метод С). У всіх випадках активність вакцини розраховують відносно стандартного препарату, каліброваного в Міжнародних одиницях (МО).

МО — активність, шо міститься у зазначеній кількості міжнародного стандарту, що складається з певної кількості дифтерійного анатоксину, адсорбованого на алюмінію гидроксид. Еквівалент МО міжнародного стандартного препарату встановлює Всесвітня Організація Охорони Здоров'я.

БСГІ вакцини для профілактики дифтерії (адсорбованої) придатний для застосування як стандартний препарат

Підбір методу визначення вакцини для профілактики дифтерії (адсорбованої) залежить від призначення. Метод А або В використовують:

1. при розробці вакцин для кількісного визначення виготовлених партій для валідації виробництва;

2. якщо необхідно провести повторну валідацію, через значні зміни виробничих процесів.

Метод А або В можуть також використовуватися для рутинного кількісного визначення партій вакцин, але з метою збереження тварин, по можливості слід застосовуватися метод С.

Метод С може застосовуватися, крім випадків зазначених вище в пунктах 1 та 2, після перевірки придатності методу для продукту. Для цих цілей відповідну кількість партій (звичайно 3) аналізують методом С та методами А або В. В тих випадках, коли різні вакцини (моновалентні або комбіновані) готують з дифтерійного анатоксину одного походження та з порівнянним рівнем (що відображено в Lf/мл) того самого дифтерійного анатоксину, придатність, показана для комбінації з найбільшою кількістю компонентів може вважатися дійсною для комбінації з меншою кількістю компонентів та для моновалентних вакцин. Будь-які комбінації, що містять такий компонент як цільноклітинний кашлюк або вакцину для профілактики інфекцій викликаних Hemophilus influensae типу b (кон'югована) з дифтерійним анатоксином або CRM 197 дифтерійним білком-носієм в одному флаконі, мають оцінюватися окремо.

Для комбінацій, що містять дифтерійний та правцевий компоненти, серологічний аналіз (метод С) мо-

І38ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4 135

же проводитись на тій же групі тварин, досліджених при серологічному аналізі вакцини для профілактики правця (адсорбованої) (2.7.8). якщо підтверджено, що звичайні умови імунізації для компонентів дифтерії та правця (наприклад, дози, тривалість) вірогідні для комбінованих вакцин.

При розробці кількісних визначень, наведєнихнижче. використовують численні розведення випробовуваного та стандартного препарату. Коли аналітик має достатній досвід роботи з методом для даної вакцини, можливе застосування спрощеної моделі, такої як одне розведення випробовуваного та стандартного препарату. Така модель дозволяє аналітику встановити, чи є активність випробовуваного препарату значно вище мінімально необхідної, але не дає інформації з лінійності, паралельності та криву доза-відповіді. Спрощена модель дозволяє значно зменшити кількість необхідних тварин, що відповідає положенню Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях.

Якщо при кількісному визначенні використовують одне розведення, час від часу слід перевіряти відгворюваність виробництва та випробування відповідними індикаторами і періодично, наприклад, кожні 2 роки, проводити повний аналіз із численними розведеннями. Для серологічного аналізу відповідними індикаторами для контролю відтворюваності випробування є:

—середнє та стандартне відхилення відносних титрів анатоксину або число зразків сироватки, отриманих після застосування фіксованих доз стандартного препарату вакцини;

—титр антитоксину або число контрольних прогонів (позитивні та негативні зразки сироватки);

—співвідношення титрів антитоксину або числа позитивних контрольних сироваток на зразки сироваток, відповідних стандартній вакцині.

МЕТОДА: ПРОВОКАЦІЙНИЙ ПІДШКІРНИЙ ТЕСТ У МУРЧАКІВ

ВИБІР ТА РОЗПОДІЛ ВИПРОБОВУВАНИХ ТВАРИН

У випробуванні використовують здорових, білих мурчаків однієї лінії та розміру, що підходять для встановленої кількості ділянок провокаційного зараження, різниця маси тіла між самою важкою та легкою тваринами не має перевищувати 100 г. Використовують мурчаків однієї статі або рівномірно розподіляють самців та самок по групах. Мурчаків розподіляють по не менше як 6 рівним групам: використовують групи, що містять достатню кількість тварин для отримання результатів, що задовольняють вимогам по вірогідному аналізу, що наведені нижче. Якщо для випробовуваного провокаційного токсину не підтверджена стабільність або він стандартизований недостатньо, у випробування включають ще 5 мурчаків, як не вакцинований контроль.

Вибирають препаратдифтерійного ТОКСИНУ, ЩО містить від 67 до 133 Іг/100 в 1 Lf і від 25 000"до 50 000 мінімально реактивних доз для шкіри мурчаків в 1 Lf. Якщо для препарату провокаційного токсину продемонстрована стабільність, перевірка активності при кожному визначенні не потрібна.

ПРИГОТУВАННЯ РОЗЧИНУ ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Безпосередньо перед застосуванням провокаційний токсин розводять підхожим розчинником для отримання розчину токсину, що містить близько 0.0512 Lf в 0.2 мл. З отриманого розчину готують серію з п'яти чотирикратних розведень, що містить близько 0.0128, 0.0032, 0.0008, 0.0002 та 0.00005 Lf в 0.2 мл.

РОЗВЕДЕННЯ ВИПРОБОВУВАНОГО ТА СТАНДАРТНОГО ПРЕПАРА TIB

Використовуючи розчин 9 г/л натрію хлориду Р готують розведення випробовуваної вакцини та стандартного препарату, таким чином, щоб для кожного отримати серіїрозведень, відмінні кроком не більше за 2.5 рази, і в яких проміжне розведення при ін'єкції підшкірної дози становило 1.0 мл на мурчака. і давало внутрішньошкірну реакцію близько 3 при провокаційному тесті у тварин.

ІМУНІЗАПІЯ ТА ПРОВОКАЦІЯ

Розведення розподіляють по 1 на кожну групу мурчаків та підшкірно вводять по 1.0 мл кожній тварині в групі. Через 28 діб проводять депіляцію обох боків тіла кожного мурчака та підшкірно кожному з них вводять по 0.2 мл 6 розведень токсину в 6 окремих ділянок, так щоб вони мінімально впливали одне на одне.

ВИЗНА ЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Якщо необхідно, невакцинованим контрольним тваринам вводять розведення, що містить 80.40.20. 10 та 5x10"6 Lf провокаційного токсину зараження.

ОБЛІК ТА ІНТЕРПРЕТАЦІЯ РЕЗУЛЬТА TIB

Всі ділянки шкіри з ін'єкціями провокаційного токсину обстежують через 48 год після ін'єкції та фіксують випадки специфічної дифтерійної еритеми. Записують кількість ділянок внутрішньошкірної провокації вільних від таких реакцій. Складають таблицю результатів внутрішньошкірної провокації для всіх тварин, що отримали те саме розведення вакцини та використовують ці дані з придатною трансформацією, такою як (число)' або агс5іп(чисдо/6):ддя отримання оцінки відносної активності для кожного випробовуваного препарат}- з використанням моделі паралельних ліній.

ВИМОГИ ДО її РНДА THOCTt ВИЗНАЧЕННЯ

Випробування вважається вірогідним, якщо:

— ддя випрожовуваної вакцини та стандартного препарату середнє число, отримане на рівні найменшої дози менше трьох та середнє число на рівні найвищої дози більше трьох:

—де застосовне, розведення токсину, що містить 40 х I O'^Lf викликає позитивну ерітему не менше ніж у SO % контрольних мурчаків та розведення, що містить 20 х 10"* Lfвикликає позитивну ерітему не менш як у SO % мурчаків (якщо не виконуються ці критерії необхідно вибрати інший токсин);

—довірчі інтервали ( Р = 0.95) складають не менше 50 % і не більше 200 % від установленої активності;

— статистичний аналіз не виявляє відхилень від лінійності та паралельності.

Випробування можна повторити, але при проведенні більше за 1 випробування результати всіх випробувань при розрахунку активності мають бути враховані.

МЕТОД В: ЛЕТАЛЬНА ПРОВОКАЦІЯ У МУРЧАКІВ

ВИБІР ТА РОЗПОДІЛ ВИПРОБОВУВАНИХ ТВАРИН

У випробуванні використовують здорових мурчаків однієїлінії, масою 250-350 г кожна. Використовують мурчаків однієї статі або рівномірно розподіляють самців та самок по групах. Мурчаків розподіляють по не менш як 6 рівних групах; використовують групи, з достатньою кількістю тварин для отримання результатів, що задовольняють вимогам вірогідного аналізу, наведених нижче. Якщо випробуваний провокаційний токсин не стабільний або він недостатньо стандартизований, у випробування включають ще 4 групи з 5 мурчаків в кожній як невакцинований контроль.

ВИБІР ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Вибирають препарат дифтерійного токсину, що має не менше 100 LDS0 на мілілітр. Якщо препарат провокаційного токсину стабільний, перевірка активності при кожному визначенні не потрібна.

ПРИГОТУВАННЯ РОЗЧИНУ ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИН

Безпосередньо перед застосуванням провокаційний токсин розводять підхожим розчинником для отримання розчину токсину, що містить близько 100 LDwAui. Якщо необхідно, використовують порції розчину токсину, розведені в тому ж розчиннику 1:32,1:100 та 1:320.

РОЗВЕДЕННЯ ВИПРОБОВУВАНОГО ТА СТАНДАРТНОГО ПРЕПАРАТІВ

Використовуючи розчин 9 г/л натрію хлориду Р. готують розведення випробовуваної вакцини та стандартного препарату, таким чином, щоб для кожного отримати серії розведень, відмінні кроком не більше за 2.5 рази, і в яких проміжні розведення при підшкірній ін'єкції по ! .0 мл на мурчака, захищали б приблизно 50 % тварин від летальних ефектів дифтерійного токсину, встановлених для даного випробування.

ІМУНІЗАЦІЯ ТА ПРОВОКАЦІЯ

Розведення розподіляють по 1 на кожну групу мурчаків та вводять підшкірно по 1.0 мл кожній тварині в групі. Через 28 діб кожному мурчаку підшкірно вводять по 1.0 мл розчину провокаційного токсину (100 LDS0).

ВИЗНА ЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ПРОВОКАЦІЙНОГО ТОКСИНУ

Якщо необхідно, розподіляють розчин провокаційного токсину та його 3 розведення по одному в 4 групах, що складаються з 5 мурчаків кожна, і вводять підшкірно кожній тварині по 1.0 мл відповідного розчину.

Враховують кількість мурчаків, що вижили через 4 доби після ін'єкції токсину. Розраховують активність випробовуваної вакцини відносно активності стандартного препарату на основі співвідношення тварин, що вижили в кожній з вакцинованих груп тварин, використовуючи звичайний метод статистичного аналізу (наприклад, 5.3).

ВИМОГИ ДО ПРИМ ШОСТІ ВИЗНА ЧЕННЯ

Випробування вважається вірогідним, якщо: —для випробовуваної вакцини та стандартного пре-

парату 50 % захисної дози знаходиться між максимальною та мінімальними дозами препаратів, введених мурчакам;

— де застосовне, кількість тварин, що гинуть в 4 групах (по 5 мурчаків у кожній) яким введено провокаційний токсин та його три розведення, вказує на те, що провокаційна доза становить 100 LDv,; —довірчі інтервали ( Р = 0.95) складають не менше 50 % та не більше 200 % від установленої актив-

ності;

— статистичний аналіз не вияаляє відхилень від лінійності та паралельності.

Випробування можна повторити, але при проведенні більше за 1 випробування результати всіх випробувань при розрахунку активності мають бути враховані.

ВИБІР ТА РОЗПОДІЛ ВИПРОБОВУВАНИХ ТВАРИН

У випробуванні використовують здорових мурчаків однієїлінії, масою 250-350 г кожна. Використовують мурчаків однієї статі або рівномірно розподіляють самців та самок за групами. Мурчаків розподіляють по не менше як 6 рівних групах; використовують групи, з достатньою кількістю тварин для отримання результатів, шо задовольняють вимогам вірогідного аналізу, наведених нижче. Якщо випробуваний провокаційний токсин не стабільний або він недостатньо стандартизований, у випробування включають ще 4 групи з 5 мурчаків в кожній як не вакцинований контроль.

СТАНДАРТНИЙ ПРЕПАРА Т

Використовують відповідний стандартний препарат такий, наприклад, як БСП вакцини для профілактики дифтерії (адсорбована) або партію вакцини, для якої підтверджена ефективність в клінічних випробуваннях, або репрезентативну партію, для якої активність розраховано в МО відносно БСП вакцини для профілактики дифтерії (адсорбованої) або міжнародного стандарту для дифтерійного анатоксину (адсорбованого).

РОЗВЕДЕННЯ ВИПРОБОВУВАНОГО ТА СТАНДАРТНОГО ПРЕПАРАТІВ

Використовуючи розчин 9 г/л натрію хлорида Р, готують розведення випробовуваної вакцини та стандартного препарату; виявлено, що відповідними є серії розведень, відмінні кроком від 2.5 до 5 разів. Використовують не менше 3 розведень в межах, наприклад, 0.5-16 МО/мл для стандартно препарату вакцини та в межах, наприклад, 1:2 та 1:125 для випробовуваної вакцини. Розведення використовують протягом 1 год після приготування. Розподіляють по 1 розведенню на кожну групу мурчаків.

ІМУНІЗАЦІЯ

Вводять кожній із дослідних тварин по 1.0 мл підшкірно розведення, що відповідає даній групі.

ЗАБІР КРОВІ

Через 35-42 доби після імунізації у кожної вакцинованої та контрольної тварини відповідним методом відбирають пробу крові.

ПРИГОТУВАННЯ ЗРАЗКІВ СИРОВАТКИ

Уникають частих заморожувань та розморожувань зразків сироватки. Для уникнення мікробної кон-

І38ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4

ВИЗНА ЧЕННЯ ТИТРУ АНТИТІЛ

Розраховують відносний титр антитіл або число кожного зразка сироватки підхожим імунохімічним методом (2.7.1). Підхожим вважаються методи, приведені нижче (імуноферментний аналіз (ELISA) та аналіз на клітинах Vero).

РОЗРАХУНОК АКТИВНОСТІ

Розраховують активність випробовуваної вакцини в МО відносно стандартного препарату, використовуючи статистичні методи (наприклад 5.3).

ВИМОГИ ДО ПРИДА ТНОСТІ ВИЗНА ЧЕННЯ

Випробування вважається вірогідним, якщо:

—довірчі інтервали ( Р = 0.95) складають не менше 50 % та не більше 200 % від розрахованої активності;

—статистичний аналіз не виявляє відхилень від лінійності та паралельності (стаття 5.3 описує можливі альтернативи при виявленні значних відхилень).

Випробування можна повторити, але при проведенні більше за 1 випробування результати всіх випробувань при розрахунку активності мають бути враховані.

Нижче наведений розділ має інформаційний характер

КЕРІВНИЦТВО:

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ВАКЦИНИ ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ДИФТЕРІЇ (АДСОРБОВАНОЇ)

МЕТОД С. ВИЗНАЧЕННЯ АНТИТІЛ У МУРЧАКІВ

ПРИГОТУВАННЯ ЗРАЗКІВ СИРОВАТКИ

Відповідним методом приготування зразків сироватки вважається метод наведений нижче. Пробірки. що містять зразки крові 6 разів перевертають та інкубують при температурі 37 °С протягом 2 год. потім при температурі 4 °С протягом 2 год. Центрифугують при кімнатній температурі на швидкості 800 g протягом 20 хв. Сироватки переносять в стерильні пробірки та зберігають при температурі нижче -20 °С. При використанні даного методу вихід сироватки складає не менше 40 %.

ВИЗНАЧЕННЯ ТИТРУ АНТИТІЛ

Нижче наведені приклади підхожих імуно.хімічних методів визначення титру антитіл — метод ЕLISA та аналіз на клітинах Vero.

135

Визначення титру антитіл п сирояятці чурчакін трерлофазннм імуноформентним аналізом (ELISA). У планшетах для EL1SA покритих дифтерійним анатоксином готують розведення випробовуваної та стандартної сироваток, У кожному планшеті передбачають позитивні та негативні контрольні сироватки мурчаків лля моніторингу відтворюваності випробування. До кон'югованнх пероксидазою антитіл кроля або кози проти IgG мурчаків. додають субстрат лля пероксидази. Вимірюють оптичну густину та розраховують тшр антитіл, використовуючи відповідний статистггчний метод (наприклад. 5.3).

Реактиви та обладнання

—Планшети для ELFSA: 96 лунок. 1-12 стовпчиків, рядів від А до Н.

—Протидифтерійна сироватка мурчаків (для вакцин для застосуваннялюдиною) (позитивна контрольна сироватка), отримана імунізацією мурчаків БСП вакцини для профілактики дифтерії (адсорбованою).

—Пероксидазний кон'югат. Кон'юговані пероксидазою антитіла кроля або кози проти IgG мурчаків.

—Дифтерійний анатоксин.

—Карбонатний буфер рН 9.6 для покриття. 1.59 г натрію карбонату безводного Р та 2.93 г натрію гідроксикарбонату Р розчиняють в 1000 мл води Р.

Отриманий розчин розливають у флакони місткістю 150 мл та стерилізують автоклавуванням при температурі 121 °С протягом 15 хв.

—Фосфатно-сольовий буфер рН 7.4 (PBS). 80.0 г натрію хлориду Р, 2.0 г калію гідрофосфату Р. 14.3 г динатрію гідрофосфату дигідрату Рта 2.0 г калію хюриду Р перемішуючи розчиняють в 1000 мл води Р. Зберігають при кімнатній температурі, уникаючи кристалізації. Перед застосуванням розчин розводять 1:9 водою Р.

—Розчин кислоти лимонної. 10.51 г кислоти лимонної Р розчиняють в 1000 мл води Р та доводять рН розчину до 4.0, використовуючи розчин 400 г/л натрію гідроксиду Р.

—Промивний буфер. PBS, що містить 0.5 г/л полісорбату 20 Р.

—Блокуючий буфер. PBS, що містить 0.5 г/л полісорбату 20 Рта 25 г/л сухих вершків.

—Субстрат д.ія пероксидази. Незадовго до використання 10 мг диамонію 2,2'-азинобіс(3-етилбензотіа золін-6-сульфонату) P(ABTS) розчиняють в 20 мл розчину кислоти лимонної. Безпосередньо перед використанням додають 5 мкл водню пероксиду розчину концентрованого Р.

Метод

Нижче як приклад наведено опис розкладки планшету. але можна це провести інакше. Лунки 1А-Н використовують для негативної контрольної сироватки, лунки 2А-Н та 12А-Н для позитивної контрольної сироватки для моніторинга аналізу. Лунки 3-11А-Н для випробовуваних зразків.

Кожну лунку планшету для EUSA покривають 100 мкл розчину дифтерійного анатоксину (0.5 Lf/мд в карбонатному буфері рН 9.6) для покриття. Інкубують протягом ночі при температурі 4 °С у вологому середовищі. Щоб уникнути ефектів температурного градієнта не складають у висоту більше 4 планшетів. На наступний день ретельно промивають планшети промивним буфером. Планшети блокують, додаючи в кожну лунку по 100 мкл блокуючого буферу. Інкубують у вологому середовищі при температурі 37 °С протягом 1 год. Планшети ретельно промивають промивним буфером. По 100 мкл блокуючого буферу додають в кожну лунку крім ряду А. Готують відповідне розведення негативної та позитивної контрольних сироваток (близько 0.01 МО/мл). та випробовуваної сироватки. Розподіляють негативну контрольну сироватку по стовпцю 1, позитивну контрольну сироватку по стовпцях 2 та 12. та випробовувану сироватку по стовпцях 3-11 і додають по 100 мкл кожної сироватки до перших 2 лунок відповідного стовпця. Використовуючи мультиканальну мікропипетку. роблять двократне серійне розведення від ряду В вниздо ряду Н, переносячи по 100 мкл з однієї лунки в наступну. Відбирають 100 мкл з останнього ряду, залишаючи тим самим у всіх лунках по 100 мкл. Інкубують при температурі 37 °С у вологому середовищі протягом 1 год. Ретельно промивають планшети промивним буфером. Готують відповідне розведення (виявлено, що відповідним є 2000-кратне розведення) пероксидазного кон'югату в блокуючому буфері та додають по 100 мкл в кожну лунку. Інкубують при температурі 37 °С увологому середовищі протягом 1 год. Ретельно промивають планшети промивним буфером. До кожної лунки додають по 100 мкл субстрату для пероксидази. Витримують при кімнатній температурі, в захищеному від світла місці протягом 30 хв. Планшети переглядають при довжині хвилі 405 нм в тому самому порядку в якому додавали субстрат.

Визначення титру антитіл в сироватці мурчаків кількісним визначенням на клітинах Vero. Використовуваний метод заснований на визначенні в кінці випробування інгібування метаболізму (метод 1), або цитотоксичності (метод 2), або мікроскопічного (клітинної морфології) чи візуального (кольорового) контролю клітин.

Межа чутливості специфічна для кожного антитоксину та звичайно складає від 0.015 МО/мл (метод 1) до 0.05 МО/мл (метод 2).

За кінцеву точку беруть найбільше розведення сироватки, що захищає клітини від дії дифтерійного токсину. Активність антитоксину розраховують відносно мурчаків або стандартного препарату ВООЗ. та виражають в МО на 1 мл.

Реактиви та обладнання:

—Плоскодонні планшети для культур тканин: 96 лунок, стовпці 1-12, ряди А-Н.

—фіакон для культури тканин 75 см2.

—Дифтерійний токсин

—Протидифтерійна сироваткамурчаків (д/ія вакцин, дія застосуваннялюдиною) (позитивна контрольна сироватка), отримана імунізацією мурчаків БСП вакцини д.ія профілактикиІ дифтерії (адсорбованої).

—Кіітини Vero (ниркові клітини Африканських Зелених мавп). Відповідними для використання являються клітин після пасажів від Р2 до Р15.

Метод 1. Дифтерійний токсин має цитопатогений ефект у відношенні клітин Vero, приводячи до їх лізісу. Антитіла проти дифтерійного токсину можуть інгібувати цей цитопатогений ефект. Отже активність вакцини для профілактики дифтерії можна не напряму визначити за допомогою цих клітинних культур, якщо різне розведення сироватки з імунізованих тварин культивувати з постійною концентрацією токсину. У визначенні клітин Vero жовтий колір вказує на життєздатні клітки, а червоний — на мертві. Якщо мертві частина клітин, колір може бути помаранчевим.

Реактиви та обладнання:

—Модифіковане MEM. Мінімальне незамінне середовище (MEM) з солями Ерла, без L-глутаміну та натрію бікарбонату.

— Модифіковане середовище 199. Середовище 199 з розчином Хенкса та L-глутаміном, без натрію бікарбонату.

—Сироватка бичача ембріональна.

—75% розчин натрію бікарбонату.

—Розчин трипсину: 2.5 % розчин трипсину.

—Розчин ЕДТА: 0.02 % розчин ЕДТА ((етилендинатрил)тетраоцтова кислота 1:5000).

—Модифікований D-PBS. фосфатно-сольовий буфер Дульбека (D-PBS) без кальцію або магнію.

—200мМрозчин L- глутамїну.

—Розчин пеніциліну/стрептоміцину

—Первинне середовище для культивування. До 50 мл модифікованого MEM додають 440 мл води Р, 5 мл 200 мМ розчину L-глутаміну та 10 мл 7.5 % розчину натрію бікарбонату. До 25 мл цього середовища додають 1.25 мл сироватки бичачої ембріональної.

—Основне середовище для культивування. Аналогічно первинному середовищу для культивування, але замість 1.25 мл сироватки бичачої ембріональної додають 0.5 мл до 20 мл збагаченого MEM середовища.

—Середовище А. До 50.0 мл модифікованого середовища 199 додають 440 мл води Р, 5.0 мл 200 мМ розчину L-глутаміну та 10.0 мл 7.5 % розчину натрію бікарбонату.

—Середовище В. До 150.0 мл середовища А додають

3.0мл сироватки бичачої ембріональної та 0.3 мл розчину пеніциліну/стрептоміцину,

—Середовище С. До 22.0 мл середовища А додають 0.44 мл сироватки бичачої ембріональної та

0.44мл розчину пеніциліну/стрептоміцину.

Клітини Vero культивують у флаконі для тканинної культури (наприклад 75 см;/250 мл) в інкубаторі при температурі 36± 1 °С, 5 % CO, та 90 % відносної вологості. З початку клітини Vero вирощують а первинному середовищі для культивування. Через 2-3 доби зростання, первинне середовище для культивування замінюють основним середовищем. Коли вже отримано виражений (конфлюентний) моношар, надосадову культуру видаляють та клітинний шар обережно промивають модифікованим D-PBS. До флакона додають 1 об'єм розчину трипсину та 1 об'єм розчину ЕДТА. Обережно перемішують флакон обертальними рухами та інкубують в середовищі CO2 в інкубаторі протягом близько 3 хв, поки клітини не почнуть відділятися від моношару. Енергійно натискають на стінки флакона для падіння клітин. Ресуспезують клітини в 5-6 мл свіжого середовища С для отримання гомогенної суспензії, що містить приблизно 1 х 10 Зклітин/мл.

По 25 мкл середовища В розливають в кожну лунку крім стовпця 1.25 мкл дифтерійної антисиворотки мурчаків (для вакцин для застосування людиною) (позитивна контрольна сироватка, робоче розведення в середовищі В 0.40 МО/мл) додають в лунки А1, А2 та А11. По 25 мкл зразків сироваток мурчаків вмішують в лунки B-G стовпців 1,2 та 11.25 мкл негативної контрольної сироватки вміщують в ряди Н стовпця 1,2 та 11. Використовуючи мультиканальну мікропіпетку проводять ряд двократних розведень по планшету (зі стовпця 2 вгору до 10 для рядів A-G та до 8 стовпця для ряду Н). Видаляють 25 мкл з лунки стовпця 10 в рящах A-G та з лунки Н8.

Дифтерійний токсин розчиняють в сольовому розчині до отримання розчину 50 МО/мл. Готують 50кратне розведення дифтерійного токсину в середовищі В для отримання робочого розчину, що вмішує 1.0 МО/мл. 25 мкл отриманого робочого розчину додають до лунок А12 та В12 (контроль токсину). Проводять ряд двократних розведень, переносячи 25 мкл з однієї лунки в іншу — з лунки В12 вниз до Н12. Наконечник міняють після кожного розведення. 25 мкл відбирають з лунки Н12. У лунки В12-Н12 додають по 25 мкл середовища В. Потім 25 мкл робочого розчину дифтерійного токсину (розведення 1.0 МО/мл) додають в кожну лунку ряду Н, зі стовпців 1-10, крім Н9 та Н10 (тільки клітини без сироватки та токсину).

Планшети накривають кришкою або іншим відповідним засобом та обережно струшують. Шаншети інкубують протягом не менше ніж 2 год у вологому контейнері в CO2 інкубаторі при температурі 37 °С. Додають 200 мкл клітинної суспензії, що містить ІхЮ'клітин/мл до всіх лунок. Планшети накривають кришкою. Інкубують при температурі 37 °С протягом 5 діб. Мікробіологічне забруднення контролюють мікроскопічним дослідженням.

Жовтого кольору лунка враховується як негативна, а лунка червоного кольору вказує на загибель клітин та враховується як позитивна. Колір між жовтим

та червоним вказує на суміш мертвих та життєздатних клітин, і вони враховуються як позитивно/ негативні. Результати по зміні кольору можуть підтверджуватися переглядом всіх клітин в лунках під мікроскопом.

Активність зразків антисироватки мурчаків отримують порівнюючи останню лунку стандартного препарату, в якому повинна спостерігатися повна нейтралізація токсину, з останньою лункою зразка, що виявив такий же ефект. Для розрахунку активності потрібно враховувати, шо кінцева точка може бути між негативними та позитивно/негативними лунками.

Метод 2: Тіазоліловий синій МТТ перетворюється в синьо/чорно формазановий продукт мітохондріальною дегідрогеназою життєздатних клітин, і таким чином він служить кількісною міткою живих клітин, що є в наявності, показуючи коли токсин нейтралізується антитоксином. Біла або безбарвна лунка вказує на відсутність життєздатних клітин внаслідок недостатньої нейтралізації токсину антитоксином.

Реактиви та обладнання:

—MEM. Мінімально незамінне середовище (MEM).

—Сироватка новонароджених телят.

—Розчин антибіотика (містить 10 000 одиниць пеніциліну, 10 мг стрептоміцину та 25 мкг амфотерецину В на мілілітр).

—200мМрозчин Ь-глутаміну.

—Трипсин-ЗДТА.

— Тіазоліл синій МТТ[3(4.5-диметилтіазол-2-ил)~ 2.5- дифенілтетразолію бромід].

— 1MHEPES буферрН 8.118.75 г HEPES розчиняють в 82.5 мл води Рта додають 30.0 мл 2Мрозчину натрію гідроксиду Р.

—Розчин глюкози (10 %).

—Готове середовище для культивування. Змішують 200 мл MEM, 10 мл сироватки новонароджених телят, 3.0 мл 1 М розчину HEPES буферу рН 8.1, 2.0 мл розчину глюкози (10 %), 2.0 мл розчину антибіотику та 2.0 мл 200 мМ розчину L- глутаміну.

—Фосфатно-сольовий буфер рН 7.4 (PBS). 10.0 г натрію хлориду Р, 0.75 г калію хлориду Р, 1.44 г динатрію гідрофосфату дигідрату Р та 0.125 г калію дигідрофосфату Р перемішуючи розчиняють у воді Рта доводять об'єм до 1000.0 мл, тим же розчинником. Якщо необхідно, доводять рН. Автоклавують при температурі 120 °С протягом 15 хв.

—Розчин тіазоліл синього МТТ. 0.1 г тіазолілу синього МТТ розчиняють в 20 мл PBS. Стерилізують фільтрацією (0.2 мкм) та зберігають в темних пляшках.

—Розчин для доведення рН. Змішують 40 мл оцтової

кисюти Р, 1.25 мл 1 М хлористоводневої кислоти

та 8.75 мл води Р.

— Екстракційний буфер рН 4.7. 10 г натрію лаури.і- сульфату Ррозчиняють у воді Р та додають 50 мл

диметшіформаміду Рі доводять об'єм розчину во-

дою Ржо 100 мл. Доводят рН розчину відповідним об'ємом розчину для доведення рН.

Клітини Vero культивують у флаконі для тканинної культури (наприклад 75 см2/250 мл) в інкубаторі при температурі (36± 1) °С, 5 % CO2 та 90 % відносної вологості. На початку клітини Vero вирощують в первинному середовищі для культивування. Через 6-7 діб зростання, коли отримано виражений (конфлюентний) моношар, надосадову культуру видаляють та клітинний шар промивають 3 рази трипсин-ЕДТА: обережно піпеткою нашаровують на середовище 0.5-1 мл трипсин-ЕДТА, флакон обертають та відсмоктують трипсин. Процес повторюють двічі, а в третій раз флакон кладуть в інкубатор та витримують протягом 5 хв, поки не почне руйнуватися моношар клітин. Енергійно натискають на стінки флакона для падіння клітин. Для отримання гомогенної суспензії ресуспезують клітини в 6-25 мл свіжого середовища для культивування, що містить приблизно 4x10 5клетин/мп

По 50 мкл середовища для культивування розливають в кожну лунку крім стовпця 1. 100 мкл дифтерійної проти сироватки мурчаків (для вакцин, що застосувуються людиною) (позитивна контрольна сироватка, робоче розведення в середовищі для культивування 0.12 МЕ/мл) додають в лунку А1 та 50 мкл в лунку А11. По 100 мкл випробовуваних зразків сироваток мурчаків, якщо необхідно розведених, вміщують в лунки B1-G1. По 50 мкл тих самих зразків додають в лунки В11-G11, відповідного ряду. 100 мкл негативної контрольної сироватки вміщують в лунку Ні та 50 мкл в лунку Ні 1. Використовуючи мультиканальну мікропипетку проводять ряд двократних розведень, переносячи по 50 мкл з однієї лунки в іншу по планшету (зі стовпця 1-10 для рядів A-G та з стовпця 1-8 для ряду Н).

Дифтерійний токсин з відомою активністю та вмістом Lf розводять, готуючи відповідний робочий запас, що містить не менше ніж 4 мінімальних ци~ топатичних доз в середовищі для культивування. По 50 мкл отриманих робочих розчинів додають в кожну лунку крім Н9 та Н10 (контрольні клітини), А11-Н11 (контроль сироватки) та А12-Н12 (контроль токсину). До лунки А12 додають 100 мкл розведеного токсину та готують двократне розведення, переносячи по 50 мкл з однієї лунки в іншу вниз по планшету (з лунки А12-Н12). Видаляють 50 мкл з лунки НІ2. До лунка Н9 та Н10 додають по 50 мкл повного середовища для культивування.

Для нейтралізації токсину планшети покривають кришкою або іншим відповідним засобом та витримують при кімнатній температурі протягом 1 год. У всі лунка додають по 50 мкл клітинної суспензії, що містить 4 х 10' клітин/мл. Планшет закривають кришкою. Інкубують при температурі 37 °С протягом 6 діб. Мікробіологічне забруднення контролюють мікроскопічним дослідженням. До кожної лунки додають по 10 мкл тіазолілу синього МТТ. Планшети інкубують при температурі 37 °С ще про-