3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

79

Рис. 19. Возможные пути трансфекции клеток с помощью липоплексов. Показана адсорбция липоплекса (ЛП) на поверхности клетки и последующий эндоцитоз. Эндосома может контактиовать с различными мембранами в цитоплазме, например, с эндоплазматичеким ретикулумом (ЭР), митохондриями (МХ) и оболочкой ядра. Показаны ядерные поры (ЯП). При этом поисходит обмен липидов, рейтрализация положительного заряда липоплекса, нарушение целостности мембран липоплекса и высвобждение ДНК в цитоплазму (1) или непосредственно в нуклеоплазму (2). Кроме того, высвобожденная в цитоплазму ДНК может попадать в ядро через ядерные поры (3).

Представляется привлекательным использовать в комбинации с катионными липидами также другие агенты, облегчающие доставку ДНК в ядро. Так, некоторые природные и синтетические катионные полипептиды различного происхождения способны участвовать в доставке макромолекул в цитоплазму и ядро и потенциально могут использоваться для повышения трансфекции [594-596]. Трансфекция может быть улучшена путем прикрепления к молекуле ДНК полипептидов, несущих сигнал ядерной локализации (СЯЛ) [585,597-600]. Недавно было показано, что полипептиды СЯЛ являются не только эффективным инструментом для преодоления барьера ядерной оболочки, но также могут служить интермедиатом транспорта макромолекул вдоль микротрубочек из периферии клетки к ядру [601]. Кроме того, в последние годы большое внимание уделялось катионному домену белка трансактиватора (Tat-белка) вируса иммунодефицита человека HIV-1 (остатки 48-60) известному как ТАТ-

80

пептид. Было обнаружено, что ТАТ-пептид или его производные, полученные путем химической модификации, могут проникать в цитоплазму посредством кавеолин-зависимого эндоцитоза жидкой фазы и способствовать доставке в ядро различных макромолекул, включая плазмидную ДНК [602,603]. Интересен также катионный пептид из яда пчелы – мелиттин и его комплексы с ДНК которые могут быть успешно использованы для доставки генетического материала в ядро [604-606].

2.5. Виросомы

Виросомы – это протеолипидые комплексы (протеолипосомы) в состав которых входят липиды и белки оболочки вируса. В их состав, прежде всего, входит белок, инициирующий слияние мембран, а также липиды, полученные из вирусных частиц или других источников. Виросомы могут содержать также белки, выделенные из других организмов (вирусного и невирусного происхождения), необходимые для выработки иммунного ответа. Виросомы получают путем солюбилизации («растворения») в детергенте и последующей реконструкции в липидный бислой белков оболочки вируса. Впервые данный термин в современной интерпретации был использован в 1975 г. для обозначения липосом, содержащих белки оболочки вируса гриппа: гемагглютинин и нейраминидазу [607]. Авторы данной работы впервые получили сферические частицы, внешне напоминающие частицы вируса. Впоследствии было проведено множество исследований, посвященных встраиванию компонентов оболочки различных вирусов в липидный бислой. Так, исследования виросом вируса Леса Семлики, вызывающего одну из форм тропической лихорадки, были начаты еще в 1977 году [608] и продолжаются до настоящего времени [609-611]. Белки вируса Сендай – белок слияния (F-белок), а также гемагглютинин-нейраминидаза (HN-белок) – были реконструированы в липиды этого вируса [612,613], а позже – в липиды из других источников [614-616]. В 1979 году в предварительно сформированные липосомы был встроен белок-G, полученный из вируса везикулярного стоматита [617]. Позже эти исследования были продолжены другими авторами [618-620]. Виросомы краснухи (вирус Рубелла) были получены встраиванием белков Е1 и Е2 в липосомы [621]. Кроме того, для получения виросом были использованы белки вируса Эпштейна-Барра [622,623], вируса лейкоза мышей Френда [624], вируса иммунодефицита человека [625], вируса герпеса [626-629], онкогенного вируса болезни Ньюкасла [630].

Однако наибольшее количество исследований посвящено виросомам, полученным на основе компонентов вируса гриппа [631-634]. Лаборатория, руководимая Яном Вилшутом из университета Гронингена (Нидерланды), разработала методику получения виросом гриппа путем реконст-

81

рукции белков оболочки вируса в липиды этого вируса в 1987 году [635]. В этом исследовании впервые было показано, что додециловый эфир ок-

таэтиленгликоля (octaethyleneglycol dodecylether – С12Е8) является наибо-

лее подходящим детергентом для реконструкции функционально активного гемагглютинина, способного инициировать слияние мембран в умеренно кислой среде (рН 5 – 6). Современная процедура получения виросом гриппа также основана на использовании этого детергента

(Рис.20).

Рис.20. Схематическое изображение последовательных стадий получения виросом из частиц вируса гриппа (а-г). Как изображено на схеме, нативная частица вируса гриппа имеет оболочку, образованную бислоем фосфолипидов, в который интегрированы белки гемагглютинин и нейраминидаза. Оболочка окружает капсид, содержащий генетический материал вируса и некоторые специализированные белки. Для получения виросом нативные вирусные частицы (а) дезинтегрируют в детергенте (б), неразрушенный капсид удаляют центрифугированием, в результате чего в супернатанте остаются белки оболочки вируса (в), которые, после удаления детергента и добавления липидов, встраиваются в бислой и образуют виросомы (г). Необходимо обратить внимание на то, что реконструированная виросома не сохраняет высокой степени упорядоченности молекул белка, характерной для оболочки вируса. Не сохраняется также исходная ориентация белков в бислое, поскольку некоторые белковые молекулы « перевернуты» и экспонируют полярную часть во внутреннее пространство везикулы. Внутри везикул могут присутствовать также неинтегрированные в бислой белки вируса. На рисунке представлена также микрофотография виросом гриппа [632,633], полученная методом негативного окрашивания (д). На поверхности частиц видны молекулы гемагглютинина. Масштабная черта 100 нм.

82

При реконструкции часть белков не встраивается в бислой и находится в растворе в форме мицелл [632,633], которые удаляются в процессе приготовления конечного продукта, тогда как часть мицелл, содержащих белки вируса, оказывается заключенной во внутреннем пространстве виросом и может играть существенную роль в развитии иммунного ответа, что будет обсуждаться далее.

Виросомы, полученные из компонентов частиц вируса гриппа без добавления посторонних липидов способны инициировать иммунный ответ [636-638]. Добавление катионных липидов позволяет использовать виросомы для доставки молекул ДНК и других полинуклеотидов [639-641]. Замена собственных липидов вируса на природные и синтетические липиды позволяет существенно упростить процедуру приготовления виросом. Виросомы с дополнительными липидами, получили название: «иммуностимулирующие реконструированные виросомы гриппа» (IRIV – immunostimulating reconstituted influenza virosomes). Впервые IRIV были предложены Глюком с соавторами в 1992 году [642] и уже нашли применение в медицинской практике [632,633,643]

IRIV могут содержать также различные лекарственные вещества, специфические рецепторы, генетический материал и антигены различных патогенных организмов, необходимые для выработки иммунного ответа. Так, в 1992 году впервые удалось использовать виросомы гриппа для доставки антигенов вируса гепатита А [642]. Для достижения наибольшей эффективности желательно, чтобы антиген был физически связан с частицами IRIV [644,645]. Широкий набор различных IRIV, предназначенных для разных целей был разработан Pevion Biotech (Берн, Швейцария) (Табл. 3).

После некоторой модификации IRIV могут использоваться для доставки нуклеиновых кислот [641,646,647], различных лекарственных веществ [648,649], антигенов белковой природы [650-652], или антигенов на основе углеводов [653]. Было также показано, что IRIV прекрасно подходят для доставки синтетических полипептидов, которые могут с успешно использоваться для стимуляции иммунного ответа [654-658].

В некоторых случаях антигены могут спонтанно адсорбироваться на поверхности IRIV посредством электростатического взаимодействия с липидами или белками поверхности виросом. Такие антигены можно просто добавить к суспензии IRIV. Таким способом была получена вакцина против гепатита Epaxal [645], которая в настоящее время применяется в медицине. Если антигены не способны прикрепляться к поверхности виросом, к ним можно прикрепить гидрофобный «якорь», способный интеркалировать в бислой и, благодаря этому, удерживать антиген на поверхности виросомы. Антигены с гидрофобным якорем необходимо добавлять в суспензию компонентов виросомы в детергенте. После удаления детер-

83

гента антиген «заякоривается» в бислой виросомы. В этом случае часть антигенов может иметь «неправильную» ориентацию и экспонироваться внутри виросом.

Таблица 3. Различные типы иммуностимулирующих реконструированных виросом гриппа IRIV [643].

Обозначения: IRIV – иммуностимулирующие реконструированные виросомы гриппа

(immunostimulating reconstituted influenza virosomes). IIRIV – иммуностимулирующие реконструированные виросомы гриппа с антигеном, интегрированным в мембрану

(immunostimulating reconstituted influenza virosomes with antigen integrated in the membrane).СIRIV – химерные иммуностимулирующие реконструированные виросо-

мы гриппа (chimeric immunostimulating reconstituted influenza virosomes). TIRIV – лио-

филизуемые иммуностимулирующие реконструированные липосомы вируса гриппа

(lyophilizable immunostimulating reconstituted influenza virosomes). CTL – цитотоксичные Т-лимфоциты (cytotoxic T-lymphocytes).

2.5.1. Механизм действия виросом

В настоящее время большинство исследуемых и применяемых на практике виросом получены на основе вируса гриппа. Связывание вируса гриппа с клеткой происходит благодаря взаимодействию вирусного белка гемагглютинина с остатками сиаловых кислот гликопротеидов или гликолипидов клетки хозяина [666]. Точнее, вирус гриппа человека связывается с остатками галактозы, прикрепленными к сиаловой кислоте в конфигурации α2 → 6, а птичий вирус гриппа предпочитает галактозу, прикрепленную к сиаловой кислоте в конфигурации α2 → 3 [667]. Вирус гриппа проникает в цитоплазму атакуемой клетки, используя путь рецепторопосредованного эндоцитоза (Рис.21). Проникнув в эндосому, вирусная частица сливается с окружающей мембраной эндосомы при увеличении кислотности среды [668,669].

84

Рис.21. Жизненный цикл вируса гриппа [633]. 1– связывание вируса с рецепторами, содержащими сиаловые кислоты. 2 – эндоцитоз вируса плазматической мембраной и образование эндосомальной везикулы. 3 – доставка вируса к эндосомальному компартменту. 4 – слияние вирусной мембраны с мембраной эндосомы (лизосомы), индуцируемое умеренно кислой средой (рН 5 – 6). 5 – доставка вирусной РНК к ядру и репликация вирусной РНК. Показан также синтез м-РНК. 6

– синтез вирусных белков в цитозоле клетки и эндоплазматическом ретикулуме. 7 – сборка новых частиц вируса.

Именно кислая среда внутри эндосом (лизосом) инициирует реакцию слияния между оболочкой вируса и эндосомальной мембраной, что является ключевым моментом в процессе инфицирования вирусом гриппа. Этот процесс связан с конформационными изменениями гемагглютинина. Процесс слияния и, соответственно, процесс инфицирования может тормозиться агентами, вызывающими защелачивание среды внутри эндосом, например, моненсином или хлорохином [668,669].

Мембраны виросом содержат белок гемагглютинин и сохраняют фузогенные способности нативных частиц вируса [670]. Также как нативная частица вируса, виросомы гриппа способны проникать в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (Рис. 22). При попадании в лизосомы некоторые частицы разрушаются, а образовавшиеся фрагменты белков представляются Т-хелперным клеткам для формирования гуморального иммунного ответа. Некоторые частицы, попав в кислую среду, сливаться с мембраной лизосомы, что приводит к высвобождению в цитоплазму неинтегрированных белковых комплексов, содержащихся внутри виросом. Как было отмечено ранее, неинтегрированные белковые комплексы образуются во внутреннем пространстве виросом в процессе сборки частиц.

Доставленные этим путем в цитоплазму белки подвергаются фрагментации ферментами протеосомы, а полученные фрагменты посредством специальных транспортеров ТАР (Transporters of Antigenic Peptides) дос-

тавляются в аппарат Гольджи, где они связываются с белками главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС II – major histocompartibility complex, class II), экзоцитируются на поверхность клетки и представляются цитотоксическим Т-лимфоцитам. В результате этого, цитоток-

85

сическая активность Т-лимфоцитов направляется на разрушение инфицированных вирусом клеток, что приводит к остановке развития вирусной инфекции [671].

Рис.22. Предполагаемый процесс формирования иммунного ответа на белки виросом [632,633,672]. Виросомы взаимодействуют с рецепторами на поверхности анти- ген-представляющих клеток иммунной системы (прежде всего, дендритных клеток), эндоцитируются, транспортируются в лизосомы, где часть виросом разрушается в лизосомах, а образовавшиеся белковые фрагменты транспортируются в аппарат Гольджи, связываются с белками главного комплекса гистосовместимости 1-го типа

(MHC I – major histocompartibility complex) и далее, посредством экзоцитоза, направ-

ляются на поверхность клетки, где представляются Т-хелперным клеткам, что в дальнейшем приводит к формированию антител в крови (гуморальный иммунный ответ). Однако, часть виросом не успевает разрушиться, поскольку кислая среда инициирует слияние виросом с мембранами лизосом, в результате чего, содержащиеся во внутреннем пространстве виросом неинтегрированные белковые комплексы высвобождаются в цитоплазму клетки. В цитоплазме эти белки доставляются к протеосомам, обладающим протеолитической активностью, где они фрагментируются, полученные фрагменты транспортируются в аппарат Гольджи, связываются с белками главного комплекса гистосовместимости 2-го типа (MHC II), экзоцитируются на поверхность клетки, где распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами, что способствует развитию процессов фагоцитоза (клеточный иммунный ответ).

86

Кроме того, благодаря способности виросом сливаться с лизосомальной мембраной и освобождать внутреннее содержимое в цитоплазму, виросомы можно использовать для доставки в цитоплазму различных веществ. Например, с помощью виросом в цитоплазму клеток опухоли можно доставлять А-субъединицу дифтерийного токсина, представленную полипептидом 20кДа, что приводит к полной остановке синтеза белка клеткой [673].

Виросомы обладают также выраженной способностью инициировать созревание антиген представляющих клеток, что, в частности, выражается в увеличении количества молекул CD80, CD86, CD40 на поверхности клеток, являющимися ко-стимуляторными сигналами для Т-клеток [674,675].

Увеличение количества этих молекул на поверхности дендритных клеток необходимо для осуществления эффективного прайминга Т-клеток без которого не может развиться иммунный ответ. Кроме того, было показано, что виросомы можно использовать для доставки ко-стимуляторных молекул к клеткам иммунной системы, что приводит к активации иммунного ответа. Этот подход может найти применение в клинической практике. Так, в лечении меланомы, использование виросом гриппа и коровьей оспы, загруженных ко-стимуляторными молекулами, находится на стадии клинических испытаний [676].

Итак, важнейшим преимуществом использования виросом является возможность активирования сразу двух ветвей иммунного ответа: гуморальной и клеточной. При этом для презентации белков через систему МНС класса I и развития гуморального ответа (появление специфических антител) достаточно пикомолярной концентрации белка, что соответствует повышению чувствительности системы в несколько тысяч раз по сравнению с использованием раствора неинкапсулированного белка [637,638]. Кроме того, с помощью виросом можно активировать Т-лимфоциты и инициировать клеточный фагоцитоз. Этот ответ всецело зависит от фузогенной способности гемагглютинина виросом, который позволяет доставлять антигены непосредственно в цитоплазму антиген-представляющих клеток. Способность доставлять антигены в цитоплазму отличает виросомы от других агентов, используемых в медицине для активации иммунного ответа. Как и многие другие липосомальные препараты, виросомы обладают такими достоинствами, как защита веществ, находящихся внутри везикулярного пространства, от действия агрессивных факторов окружающей среды (например, от действия литических ферментов). Инкапсулирование веществ внутри виросом позволяет снизить токсическое действие лекарств на организм, а возможность доставки лекарств непосредственно в цитоплазму существенно повышает эффективность терапевтического воздействия [634,643,675].

87

2.5.2. Применение виросом в медицине

В настоящее время, в медицине нашли применение виросомы гриппа, поскольку вирус гриппа наиболее полно исследован и наиболее доступен в экспериментальной и клинической практике. Вакцинация (иммунизация) против гриппа имеет более чем 50-ти летнюю историю, а ее применение считается наиболее экономически эффективным [643]. Первая виросомальная субъединичная вакцина против гриппа Инфлексал B (Inflexal V), производимая Crucell (прежнее название Berna Biotech Ltd.)

исследуется с 1992 г., а с 1997 г. она была допущена к широкому применению. К 2009 г. было произведено более 40 миллионов доз вакцины. Эта вакцина против гриппа, содержащая поверхностные антигены вирусов гриппа А и В, разрешена к применению для всех групп населения. Она проявляет высокую иммуногенность даже в группах населения с ослабленным иммунитетом, включая пожилых и детей [677,678]. Она также безопасна для страдающих аллергиями, в частности, аллергической реакцией на яичный белок [679].

Высоко эффективной и низко реактогенной, особенно при вакцинации пожилых людей, признана также виросомальная субъединичная вак-

цина Инвивак (Invivac), выпускаемая фирмой «Solvay Pharmaceuticals»,

которая сравнивалась с другими вакцинами против гриппа в нескольких клинических испытаниях [680,681]. Эта вакцина была одобрена для применения в странах Евросоюза в июле 2004г. Она содержит вирусные белки гемагглютинин и нейраминидазу, встроенные в липидный бислой. Было обнаружено, что вакцина Инвивак обладает такой же иммуногенной активностью, как и обычные вакцины, для лиц, уже имеющих антитела против вируса гриппа, но показала существенные преимущества (примерно на 30%) для людей, впервые иммунизированных против вируса гриппа. Вакцина Инвивак, как и большинство вакцин гриппа, может вводиться внутримышечно или подкожно, но, в настоящее время, исследуется также возможность интраназального введения данной вакцины. Кроме того, Инвивак не вызывает аллергических реакций у людей, чувствительных к присутствию яичного белка. В целом, пониженная иммуногенность и хорошая переносимость отличает виросомальные вакцины от традиционных, полученных на куриных эмбрионах и содержащих компоненты яичного белка.

В странах Европы широко применяется также виросомальная вакцина Эпаксал (Epaxal), выпускаемая Berna Biotech с 1994 г., и разработанная Шведским институт вакцины и сыворотки, расположенным в Берне. В России эта вакцина зарегистрирована, как разрешенная к использованию,

88

в октябре 2007 г. Вакцина предназначена для предотвращения инфекции гепатитом А. В состав вакцины входят виросомы гриппа, образованные поверхностными антигенами вируса гриппа, встроенными в бислой из смеси лецитина (80%) и кефалина (20%). К поверхности виросом прикреплены частицы инактивированного формалином вируса гепатита А [682]. В сравнении с другими вакцинами против гепатита, Epaxal отличается наилучшей переносимостью, хотя ее иммуногенные свойства сравнимы с обычными вакцинами. Виросомальная вакцина Epaxal особенно рекомендована для применения у пожилых людей [683,684]. Она также признана эффективной и безопасной при применении на больных гепатитом детях, начиная с 1 года [685,686] и, даже, с 6-ти месячного возраста [687].

Большое значение уделяется также разработке вакцины против малярии. Ежегодно до полумиллиарда людей заражается малярией, при этом умирает 2 – 5 миллионов [688]. Лекарственные средства и инсектициды оказывают лишь частичное воздействие на распространение заболевания в связи с появлением устойчивости к препаратам. Несмотря на огромные усилия, до сих пор не разработано эффективной вакцины против малярии [689]. Большие надежды возлагаются на получение эффективных виросомальных вакцин гриппа, способных вырабатывать иммунитет против малярийного плазмодия (Plasmodium falciparum). Так, сообщалось о возникновении антител с длительным ингибирующем действии на паразита in vitro. Было показано, что сыворотка, полученная от иммунизированных добровольцев, препятствовала инвазии паразита в гепатоциты [690]. Недавно было проведено клиническое испытание второй фазы, в котором впервые использовалась виросомальная вакцина объединяющая две существующие стратегии вакцинации против малярии. А именно, вакцина индуцировала иммунный ответ как на пред-эритроцитарную стадию, так и на паразита, находящегося в кровяном русле. К сожалению, обнаруженный иммунный ответ оказался неожиданно слабым. Иммунизация не защитила ни одного из испытуемых от действия паразита [691]. В испытании первой фазы на виросомальном препарате (IRIV), содержащем синтетический полипептидный антиген малярии, инициировал долговременный иммунный ответ на уровне антител против данного пептида [692]. Несмотря на недостаточную защиту от паразита, вакцины продемонстрировали появление антител. Предполагается, что дальнейшее улучшение вакцины должно идти по пути увеличение количества антител в ответ на поверхностные антигены виросом и усиление фагоцитарной активности, за счет большей стимуляции Т-клеток инкапсулированными антигенами

[693].