3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

169

достаточна для терапевтического применения [1230]. Выпускаемый в США препарат эхогенных липосом Дефинити (Definity ® ) содержит смесь липидов: дипальмитоил-фосфатидилхолин, дипальмитоил-фосфатидная кислота и дипальмитоил-фосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль 5000. Присутствие в составе липосом отрицательного заряженной фосфатидной кислоты может препятствовать агрегации липосом вследствие электростатического расталкивания, а наличие полиэтиленгликоля препятствует удалению липосом из русла крови ретикулоэндотелиальной системой, что существенно увеличивает время циркуляции липосом в крови.

Электронная микроскопия эхогенных липосом, полученных из смеси фосфолипидов и холестерина, свидетельствует о наличии довольно сложной структуры, в которой сочетаются пространства, заполненные газом и водой (Рис.28). В соответствии со схемой, в таких липосомах области, заполненные газом, окружены монослоем липидов, тогда как области, заполненные водой, окружены бислоем. Такие липосомы можно назвать многосекционными. Они содержат секции, заполненные газом, и секции заполненные водой. Последние могут содержать также водорастворимые лекарственные вещества, которые будут высвобождаться при активации липосом ультразвуком.

Рис.28. Крио-трансмиссионная электронная микроскопия (а) и схематическое изображение (б) эхогенных липосом, полученных из смеси фосфолипидов и холестерина.

4.5.3. Применение эхолипосом в медицине

Микроскопические и субмикронные пузырьки газа, стабилизированные поверхностно-активными веществами различной природы, в число которых входят также липидные пузырьки – эхолипосомы, находят все большее применение в медицине. Можно выделить несколько аспектов их потенциального или уже существующего применения в медицине

171

Эхолипосомы могут использоваться для ультразвуковой визуализации различных патологических процессов, включая язвы и воспаления

[1233-1236], опухолевый ангиогенез [1237-1240] и ишемию [1241-1244].

Для этих целей в кровеносную систему вводится катетер, позволяющий наблюдать места скопления ультразвуковых контрастеров. Например, можно наблюдать тромбы в желудочке сердца, окруженные ультразвуковыми контрастерами, имеющими сродство к тромбам (Рис.30). Для этого катетер вводится через легочную вену в левое предсердие, а затем – в левый желудочек.

Рис.30. Наблюдение тромба в сердце собаки с помощью ультразвукового катетера [1226]. Показано исходное изображение (слева) и после введения в вену эхолипосом, обладающих сродством к тромбам (справа). Стрелкой показано присутствие тромба в области ушка предсердия (auricular appendage). Обозначения: LAA – левое ушко предсердия, LA – левое предсердие, AO – аорта. На рисунке представлена часть (секция) полного кругового изображения, которое обычно можно наблюдать с помощью катетера, введенного в кровеносную систему.

4.5.5. Преодоление гематоэнцефалического барьера

Существует препятствие для проникновения лекарственных веществ в ткани головного и спинного мозга. Это препятствие обусловлено наличием гематоэнцефалического барьера. Барьер представляет собой специализированную систему клеток эндотелия, выстилающих стенки капилляров, служащую для защиты мозга от вредных веществ, присутствующих в русле крови, но при этом, обеспечивающей снабжение мозга необходимым питанием [1245-1247]. Клетки эндотелия сосудов мозга образуют сплошную стену, непроницаемую для водорастворимых веществ. Кроме того, клетки соединены друг с другом плотными контактами (tight junction), вследствие чего пространство между клетками также непроницаемо (Рис.31).

Хотя гематоэнцефалический барьер проницаем для некоторых малых молекул и ионов, он создает существенное препятствие для молекул

172

большего размера к которым относятся многие лекарственные вещества. Контроль движения веществ через клетки осуществляется с помощью специфических транспортных систем, среди которых особое место занимает группа АВС переносчиков [1248,1249]. Контроль переноса больших полимерных молекул и частиц происходит с участием различных форм эндоцитоза.

Рис.31. Схематическое изображение эндотелиальных клеток капилляров мозга, образующих гематоэнцефалический барьер (а). ПК – плотные контакты. Показаны также пути проникновения веществ через эндотелиальные клетки (б). 1 – проникновение жирорастворимых веществ непосредственно через липидный бислой клеточных мембран. 2 – проникновение с участием белковых переносчиков. 3 – трансцитоз водорастворимых веществ. 4 – более сложные пути эндоцитоза/экзоцитоза с участием различных компонентов цитоплазмы (эндосомы, лизосомы, аппарат Гольджи).

Наличие гематоэнцефалического барьера является существенным препятствием для использования лекарственных веществ, которые потенциально могли бы служить для лечения различных заболеваний нервной системы, но оказываются неэффективными вследствие недостаточной проницаемости гематоэнцефалического барьера. Существуют разнообразные методы химического и физического воздействия, способствующие увеличению проницаемости гематоэнцефалического барьера для лекарственных веществ [1245,1250,1251]. Недавно было показано, что проницаемость гематоэнцефалического барьера может быть существенно увеличена под действием направленного луча ультразвука, который можно посылать с поверхности головы вглубь мозга виде кратковременного импульса [1252]. Благодаря локальному использованию направленного потока энергии ультразвука высокой интенсивности, можно кратковременно и обратимо увеличивать проницаемость эндотелия в определенных областях мозга. Среди этих методов ультразвуковая обработка с использованием эхогенных липосом занимает особое место. Адресная доставка эхогенных липосом к эндотелиальным клеткам мозга и последующая ультразвуковая обработка (Рис.32) позволяет существенно снизить пороговые значения интенсивности потока ультразвука, необходимые для увеличения проницаемости эндотелия [1253], а также увеличить специфич-

173

ность обработки областей, подлежащих терапевтическому воздействию [1254]. При этом, через барьер могут проходить большие молекулы, например, пероксидаза хрена – белок с молекулярной массой около 40 кДа

[1255].

Рис.32. Адресация эхогенных липосом (ЭЛ) к поверхности клеток эндотелия мозга. Изображен капилляр, стенки которого выстланы клетками эндотелия. В просвете капилляра находятся эхолипосомы, загруженные лекарственным веществом (звездочка). На поверхности липосом имеются лиганды к рецепторам (Рц), находящимся на поверхности клеток эндотелия (а). Направленный с поверхности головы сфокусированный луч ультразвука вызывает кавитацию эхогенных липосом, в результате чего продуцируется вторичный локальный поток ультразвука, способствующий увеличению проницаемости клеток эндотелия в непосредственной близости от места прикрепления липосом. Проницаемость эндотелия может быть увеличена благодаря нарушению целостности плотных контактов (1), или вследствие повышения проницаемости фосфолипидного бислоя клеточных мембран (2).

4.5.6. Доставка лекарственных веществ эхолипосомами

Как отмечалось выше, ультразвук увеличивает проницаемость мембран. Это явление можно использовать для доставки лекарственных веществ и генетического материала в цитоплазму клеток. Существенный прогресс в снижении порогового значения ультразвука и увеличении специфичности доставки лекарственных веществ может быть достигнут при адресации [1256,1257] эхогенных липосом к соответствующим клеткаммишеням (Рис.33).

Эхогенные липосомы способны удерживать водорастворимые вещества и высвобождать их при действии ультразвука, как это было показано экспериментально на липосомах, содержащих папаверин [1258]. Были созданы также стабилизированные липидом микропузырьки, которые можно адресно доставлять к разнообразным мишеням [1259-1262]. Так, исследовались микропузырьки, конъюгированные с моноклональными

174

антителами против эндоглина (CD 105), или VEGFR-2 рецептора опухолевой васкулатуры [1263]. Эхогенные липосомы, могут быть направлены также к внутримышечным имплантатам клеток костного мозга. Их последующая обработка ультразвуком способствовала стимуляции ангиогенеза и улучшала приживаемость имплантатов [1264]. Было также обнаружено, что действие акустического поля может способствовать скоплению микропузырьков газа в области патологически измененной васкулатуры, что также можно использовать в терапевтических целях [1265].

Рис.33. Различные пути доставки лекарственных веществ, при действии ультразвука на эхогенные липосомы. Эхогенная липосома с лигандом прикрепляется к рецептору на поверхности клетки. В результате активации ультразвуком липосома продуцируют вторичное излучение, соответствующее базовой частоте облучения, а также частотам гармоник. Вторичное излучение локально действует на мембраны близлежащих клеток, вызывая увеличение проницаемости бислоя и проникновение в цитоплазму лекарственных веществ (а); способствует слиянию эхогенных липосом с плазматической мембраной, в результате чего находящиеся в липосомах лекарственные вещества проникают в цитоплазму (б); или вызывает увеличение проницаемости мембран эндосом, что приводит к высвобождению лекарств из липосом, проникших в клетку в результате эндоцитоза (в).

Много исследований посвящено использованию эхогенных липосом для доставки генетического материала. Правильный подбор условий и интенсивности действия ультразвука позволяет многократно повысить трансфекцию клеток плазмидной ДНК [1259,1266]. Способность ультразвука проникать глубоко в ткани позволяет повысить экспрессию генов при трансфекции таких внутренних органов, как печень, при введении липосом через портальную вену [1267], или миокарда [1239]. Существенный прогресс был достигнут при инициации ультразвуком доставки короткой интерференционной РНК (si-RNA), подавляющей экспрессию ге-

нов [1268].

4.5.7. Тромболиз с помощью эхогенных липосом

Кавитация пузырьков воздуха под действием ультразвука может способствовать разрыхлению и лизису венозных и артериальных тромбов. Первые модельные исследования, показавшие возможность разрушения

175

тромбов с помощью ультразвука, были проведены в середине 1990-х [1269]. Использование микропузырьков газа позволяет существенно снизить пороговые значения интенсивности ультразвука, необходимые для разрушения тромба. Для этих целей можно использовать ультразвук невысокой частоты (единицы мегагерц или, даже, десятки килогерц), который хорошо приникает в ткани на большую глубину [1242,1270]. Это позволяет использовать источники направленного ультразвука, находящиеся на поверхности тела, например, на поверхности головы, для разрушения тромбов сосудов мозга [1231]. Стабильность эхо контрастеров и высокая их концентрация в области тромба является важным условием повышения эффективности тромболиза. Для этих целей пузырьки должны быть заполнены высокостабильными, инертными и нерастворимыми в воде газами с большим молекулярным весом и сравнительно высокой температурой кипения, например, перфторуглеродами [1242,1243]. Среди факторов кавитационного процесса, способствующих разрушению тромба, следует упомянуть образование ударных волн, потоков частиц, достигающих скоростей в сотни метров в секунду, и появление свободных радикалов [1223,1271]. Это способствует проникновению тромболитических лекарств вглубь тромба, то ускоряет процесс его разрушения [1272].

Эхолипосомы могут содержать на поверхности различные лиганды, что позволяет нацеливать их на ткани с различными патологическими изменениями. Среди лекарственных веществ, способствующих разрушению тромба, наиболее широкое применение получил тканевой плазмилоген активатор (tPA). Этот агент, разрешенный в США к использованию для лизиса тромбов при остром тромбозе, обычно добавляется в русло крови [1270]. В последние годы разрабатываются новые методы использования эхогенных липосом, загруженных tPA [1270,1273-1276]. Так, липосомы с тканевым активатором плазминогена позволяют доставлять эхолипосомы к атеросклеротическим бляшкам с диагностической и терапевтической целями [1273]. Предполагается направленная доставка таких липосом к тромбу и последующее высвобождение tPA под действием ультразвука, что существенно ускоряет процесс разрушения тромба [1270,1275-1278].

Ультразвуковые контрастеры используются в медицине уже более 15-ти лет. Первый ультразвуковой контрастер Альбунекс (Albunex® ) был выпущен в США фирмой Molecular Biosystems, San Diego, Ca. Этот пре-

парат разрешен к использованию в медицине с 1994 г. Его улучшенная версия появилась под торговой маркой Опситон (Opsiton TM) в 1997 г. Позже еще два препарата получили разрешение на использование в США.

Это были Дефинити (Definity ® ) в 2001 г. и Имагент (Imagent® ) в 2002 г.

Кроме того, в медицине используются препараты Канадского и Европейского производства [1279]. Липосомальные микропузырьки Definity, размер которых несколько меньше микрона [1280], и их усовершенство-

176

ванные модели MRX-801, MRX-815, выпускаемые ImaRX Therapeutic Inc.,

могут использоваться для тромболиза. Исследование препарата Definity показало, что при действии пульсов ультразвука 120 кГц происходит существенное (около 26%) уменьшение размеров и массы тромбов. Кроме того, повышается проницаемость тромбов для литического агента tPA, добавленного в русло крови или загруженного внутрь липосом [1281]. Более чем 30-ти летние исследования сонотромболиза к настоящему времени достигли стадии клинических испытаний, в которых было продемонстрировано успешное использование ультразвука в сочетании с липидными пузырьками на процессы тромболиза [1277,1282].

4.6. Магнитолипосомы

Использование магнитных микро- и наночастиц в качестве агентов терапевтического воздействия постоянно возрастает за последние годы [1283,1284]. Достоинством магнитных наночастиц является возможность их контролируемой доставки в нужную область за счет создания градиента магнитного поля [1285,1286], возможность визуализации процесса доставки с помощью ЯМР [1287-1290], а также возможность инициации высвобождения доставляемого терапевтического агента путем нагрева частиц в магнитном поле или инициации гибели клеток опухоли в результате локальной гипертермии [1291-1294].

Для доставки лекарственных веществ наноконтейнеры, содержащие одновременно магнитные частицы и терапевтические агенты (лекарства, радионуклиды, генетический материал) вводят в кровь с помощью шприца или катетера и, благодаря созданию градиента магнитного поля, концентрируют в заданных областях тела. Наноконтейнеры, сконцентрированные в областях, подлежащих терапевтическому воздействию, должны высвобождать терапевтический агент, который в дальнейшем доставляется к соответствующим клеткам посредством диффузии. Поле может вызывать также дополнительные движения магнитных частиц [1295-1297], приводящие к нарушению целостности контейнера, или прочности связи (например, вследствие повышения температуры) что может стимулировать высвобождение доставляемого агента (Рис.34). Высвобождение лекарства может быть инициировано также в результате изменения рН среды, ферментативной активности, осмотических сил и т.д. [1298,1299].Таким образом достигается эффективная направленная доставка веществ к определенным органам без хирургического вмешательства.

177

Рис.34. К магнитным наночастицам (темно-серые кружки) прикреплены две разные молекулы лекарства (белый и черный кружки). Для прикрепления служат нити ДНК разной длины (12-мер и 24-мер). Слабый электромагнитный импульс (ЭМИ) с частотой 350-400 кГц вызывает высвобождение одного лекарства (белый кружок) вследствие повышения температуры. Второе лекарство, прикрепленное более длинной нитью, высвобождается под действием ЭМИ большей мощности [1295].

4.6.1. Свойства магнитного поля и магнитных частиц

В применении магнитного поля для доставки веществ существуют определенные ограничения. Главное ограничение касается силы магнитного поля, которое допустимо применять. Применение сильного магнитного поля, возможно, небезопасно для здоровья. В теле человека имеется ряд белков, содержащих атомы железа и потенциально способных реагировать на внешнее магнитное поле. Среди них следует назвать гемоглобин, гемосидерин, ферритин, трансферрин, различные цитохромы. Исследования ферритина в различных тканях (мозг, печень) показали, что кластеры этого белка размером в несколько нанометров можно рассматривать как невзаимодействующие с полем частицы [1300]. Однако более крупные частицы и пленки ферритина, полученные искусственно, могут подвергаться значительному влиянию магнитного поля, что может использоваться для решения различных практических задач [425,1301]. Магнитное поле может влиять на каталитические свойства цитохрома с [1302]. Кроме того, имеются данные о влиянии магнитного поля на белки, не содержащие железа, например, на функционирование белка коннексина, участвующего в формировании щелевых контактов [1303]. В мировой практике приобретает популярность использование магнитного поля в терапевтических целях. Хотя научные исследования не выявили наличия какого-либо благоприятного действия магнитного поля [1304], существует возможность его влияния на восприятие боли [1305]. Магнитное поле низкой частоты может рассматриваться скорее как фактор риска развития нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона [1306]. Поле может влиять на тонус сосудов, оказывая вазодилататорное или вазоконстрикторное действие [1307]. Существует также опасение относительно возможного канцерогенного действия сверхнизкочастотного магнитного поля [1308].

178

Основываясь на данных клинических исследований, американское агентство FDA (Food and Drug Administration) до 1987 г. рассматривало магнитное поле менее 2Т, как источник несущественного риска [1284,1309]. В 1996 г. несущественным считалось уже поле 4Т. В 2003 г. предельное значение было повышено до 8Т, хотя было показано, что такое поле может снижать скорость потока крови на 30% in vitro и может влиять на поведение эритроцитов [1310]. В то же время, клинические исследования действия поля 8Т не выявили никаких необратимых патологических нарушений [1311]. Исследования показывают, что поле 10Т, хотя и влияет на кровоток, можно рассматривать как безвредное [1312], или вызывающее обратимые изменения при кратковременном (10 сек) действии [1313]. Сейчас разрабатываются приборы, в которых используется сверхмощное магнитное поле 12Т [1314]. Влияние этого поля на живые объекты пока мало изучено.

В медицинской практике для адресации наночастиц используются магнитные поля значительно меньшей напряженности. Поле 0,2 Т вполне достаточно для этих целей, хотя длительность действия поля может составлять десятки минут [1283]. Современные постоянные магниты на основе сплава Nd-Fe-B позволяют создавать магнитные поля достаточной силы для мониторинга наночастиц в теле на глубине до 10 – 15 см [1284]. При этом чрезвычайно важно контролировать форму магнитного поля, поскольку оно может распространяться не только в области терапевтического воздействия, но и в окружающих тканях [1315,1316]. Более точная манипуляция может достигаться при использовании имплантированных в тело магнитов [1317].

Важен также выбор подходящего материала для создания частиц. Известно, что различные материалы по разному реагируют на действие внешнего магнитного поля. Парамагнитные материалы очень слабо магнетизируются вдоль направления магнитного поля. Диамагнитные материалы магнетизируются в направлении, противоположном внешнему полю. Ферромагнитные материалы магнетизируются строго в направлении магнитно поля и способны сохранять намагниченность после того, как внешнее магнитное поле удалено [1283,1318,1319]. При этом ферромагнитные материалы взаимодействуют друг с другом даже после исчезновения внешнего поля, проявляют тенденцию образовывать большие агрегаты, что может приводить к закупорке сосудов. Ферромагнетизм связан с размером частиц. Частицы достаточно малого размера испытывают быстрые температурные флуктуации в результате которых суммарная величина намагниченности становится равной нулю. Такие частицы, даже если в их состав входит ферромагнетик, не имеют остаточной намагниченности после удаления поля и не образуют агрегатов. Однако в достаточно сильном внешнем магнитном поле их потенциальная энергия намагниченно-