3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

99

3.1.4. Формула Кедема-Качальского

Для того, чтобы контролировать накопление частиц в областях развития воспалительных процессов и опухолях важно понимать, какие факторы ответственны за процесс пассивной адресации. Как было отмечено выше, эти области характеризуются повышенной проницаемостью сосудов, приводящем к развитию оттека. С потоком жидкости частицы проникают через стенки капилляра в окружающие ткани посредством фильтрации. Для математического описания фильтрации частиц, размером в несколько десятков нанометров, можно использовать формулу Кедема и Качальского [775,776], которую, в данном случае, следует написать:

шедших через стенку капилляра. Имеется также коэффициент отражения (σ), определяющий фракцию частиц не прошедших через стенку капилляра. Предполагается, что σ + ε = 1

В представленном выражении (1) величина Jv не связана непосредственно со свойствами частиц, а определяется развитием процесса воспаления. Коэффициент ε характеризует проницаемость стенок капилляров для частиц данного диаметра. Следовательно, главной переменной величиной, определяющей распределение частиц в организме, является их концентрация в крови Сs. Концентрация частиц является функцией времени Сs(t), прошедшего с момента введения суспензии в кровь.

Если количество частиц в единичном объеме крови равно N, а время фильтрации t, то поток частиц через единичную площадь поверхности капилляра будет равен:

Объединив выражения (1) и (2) и произведя интегрирование, получа-

ем:

В соответствии с формулой (3), количество частиц в тканях пропорционально площади под кривой (ППК), описывающей зависимость изме-

100

нения концентрации частиц в крови от времени. Величина ППК (в англоязычной литературе: AUC – area under curve) является важным параметром, определяющим способность частиц накапливаться в области терапевтического воздействия в результате пассивной адресации [777,778]. Данный вид адресации зависит от способности частиц проникать сквозь барьер эндотелия пропорционально их концентрации в крови. Этот процесс не зависит от модификации поверхности частиц такими полимерами, как ПЭГ, или способности частиц специфически взаимодействовать с некоторыми клетками, что может достигаться прикреплением антител или лигандов к поверхности частиц. Определяющим фактором является только концентрация частиц в русле крови. Стерически стабилизированные, покрытые ПЭГ, липосомы накапливаются в тканях опухолей в бó льших количествах, чем немодифицированные липосомы только потому, что они способны дольше циркулировать в крови, т.е. их концентрация в крови поддерживается на высоком уровне в течение более длительного времени. Однако лиганды и антитела на поверхности наночастиц все же важны для успешной доставки лекарств. Они позволяют отличать здоровые клетки от трансформированных. Кроме того, как это будет обсуждаться в соответствующих разделах, специфическая адсорбция частиц на поверхности клеток может способствовать их эндоцитозу и доставке лекарственного вещества в цитоплазму. Следует также отметить, что процессы пассивной адресации наблюдаются только при выходе частиц из поврежденных капилляров в окружающие ткани. Для адресации частиц к клеткам, находящимся на стенках сосудов, и следовательно, движущихся в русле крови, необходимо их активное взаимодействие с поверхностью клеток. В этом случае активная адресация частиц с помощью лигандов или антител становится особенно необходимой.

3.1.5. Выход лекарств из липидных наноконтейнеров

Находясь внутри липидных частиц, лекарство не может проявлять активности. Для этого оно должно выйти в окружающую среду. Высвобождение лекарства из липосом могут определять время, место и продолжительность терапевтического эффекта. Для проявления терапевтического действия важно не только общее количество доставленного вещества, но и кинетические параметры его высвобождения [737]. Кинетические кривые, описывающие высвобождения лекарства из липосом могут иметь различную форму (Рис. 5 ).

Для многих лекарств соотношение между терапевтическим действием и концентрацией лекарства нелинейно. Важнейшими характеристиками являются полупериод выхода лекарства, а также максимальная концентрация лекарства в тканях, достигаемая в результате выхода При этом концентрация лекарственного агента должна находиться в пределах тера-

102

кратко обсуждались различные пути адресной доставки наноконтейнеров к поверхности клеток, на которые направлено терапевтическое воздействие. Более подробно эти вопросы будут рассмотрены в следующих разделах книги. Однако достижение поверхности клеток не достаточно для осуществления воздействия. Доставляемые агенты должны покинуть контейнеры и достичь соответствующих мишеней, которые могут находиться на поверхности клетки или в цитоплазме. В некоторых случаях требуется дальнейшая адресация веществ к определенным клеточным компартментам. Адресация внутри цитоплазмы необходима для лечения заболеваний, связанных с патологией таких органелл, как митохондрии [779,780], лизосомы [781,782], аппарат Гольджи [783]. Во многих случаях необходима доставка веществ (например, ДНК) в ядро [784,785].

Разнообразные возможности взаимодействия липосом с клетками были подробно рассмотрены в книге Л.Б. Марголиса и Л.Д. Бергельсона, опубликованной в 1986 г. [786]. Авторы подробно рассмотрели различные способы взаимодействия липосом с поверхностью клетки и пути проникновения материала в цитоплазму (Рис.6). По прошествии четверти века после написания книги, необходимо признать, что многие аспекты взаимодействия липосом с клеткой, изображенные на схеме, сохранили актуальность и получили дальнейшее развитие. Кроме того, многие процессы проникновения веществ в клетку до сих пор недостаточно изучены.

Рис.6. Возможные способы взаимодействия липосом с клетками по Марголису и Бергельсону. Молекулы лекарственных веществ обозначены черными точками.

Как показано на схеме, адсорбция частиц на поверхности клетки может сопровождаться локальным увеличением проницаемости мембран и проникновением веществ в цитоплазму. В настоящее время этот способ доставки веществ используется. Для этого проницаемость плазматической мембраны необходимо инициировать, что может быть достигнуто, напри-

103

мер, посредством ультразвука, как это будет подробнее рассмотрено в соответствующем разделе книги. Известно, что некоторые вирусы имеют оболочку, способную сливаться с плазматической мембраной, как это показано на схеме, что можно использовать для доставки веществ в цитоплазму. Липосомы, содержащие вирусные белки также могут доставлять лекарственные вещества в цитоплазму путем слияния с плазматической мембраной.

Плазматическая мембрана является барьером для проникновения веществ в клетку. Малые молекулы могут преодолевать этот барьер с использованием специализированных белковых каналов или транспортеров. Частицы больших размеров проникают в клетку с помощью процессов, называемых эндоцитозом. Показанный на схеме обмен липидами между липосомой и клеточными мембранами, а также слияние между ними, может происходить не только на поверхности клетки, но также и после интернализации липосом в клетку посредством эндоцитоза. Эти процессы способствуют высвобождению веществ в цитоплазму и доставке к внутриклеточным мишеням [2,785]. Размер частиц имеет большое значение для инициации эндоцитоза. Во многих случаях для эффективного проникновения в клетку частицы должны иметь субмикронные размеры [733,787-790]. Часто оптимальным является размер в пределах 100 – 200 нм. Некоторые клетки, например фагоциты, лучше захватывают более крупные частицы до 500 нм [788]. ДНК-липидные комплексы – липоплексы лучше проникают в клетку, если их размеры составляют несколько микрон [791].

Исследование механизмов эндоцитоза частиц и их перемещения в цитоплазме является чрезвычайно сложной задачей. Во-первых, потому, что существует множество путей эндоцитоза и с каждым годом картина становится все более сложной [792]. Во-вторых, потому, что выбор пути проникновения частиц зависит от множества факторов, включая размеры частиц, их заряд, присутствие различных химических групп на поверхности. Клетки различного происхождения сильно отличаются в выборе путей эндоцитоза. Более того, выбор путей может изменяться в зависимости от физиологического состояния клетки. В-третьих, клетки могут использовать одновременно несколько различных путей эндоцитоза для частиц одного вида. В этом случае приходится говорить лишь о предпочтительных путях эндоцитоза этих частиц в клетку.

Среди известных форм эндоцитоза, в качестве упрощения, можно выделить основные, наиболее изученные формы: клатрин-зависимый эндоцитоз, макропиноцитоз или близкий к нему фагоцитоз, а также кавео- лин-зависимый эндоцитоз (Рис.7).

104

Рис.7. Основные виды эндоцитоза. 1 – клатрин-зависимый эндоцитоз (КлЗЭ) с участием окаймленных клатрином ямок (ОЯ) и образованием окаймленных клатрином везикул (ОВ). На схеме также изображен клатрин (Кл) и нити актина (Ак), участвующие в формировании инвагинации плазматической мембраны и перемещении везикул в цитоплазме. Эндоцитируемые везикулы сливаются с ранними эндосомами (Ран.Энд), при этом, как показано стрелками, дальнейший путь переноса веществ может расходиться в нескольких направлениях. Так, эндоцитируемый материал может скапливаться на периферии цитоплазмы в рециклируемых эндосомах (Рец.энд.) и возвращаться обратно на поверхность клетки для повторного использования материала в эндоцитозе или, благодаря взаимодействию с микротрубочками (Микр.Труб), эндосомы могут продолжать движение вглубь цитоплазмы к центру организации микротрубочек (ЦОМ), расположенному рядом с ядром. При этом, в процессе созревания, ранние эндосомы сливаются с поздними эндосомами (Поз.энд.), которые обмениваются материалом с транс-цистернами аппарата Гольджи (ТрансГольджи), и, наконец, сливаются с лизосомами (Лиз.), которые располагаются вокруг ядра в перинуклеарной области. На схеме изображено также ядро и показаны ядерные поры (ЯП). 2 – фагоцитоз или макропиноцитоз (МПЦ). Показаны манжетовидные выпячивания плазматической мембраны и нити актина (Ак), участвующие в формировании выпячиваний. Образующиеся макропиносомы (Мпс) сливаются с ранними эндосомами после чего материал может транспортироваться по направлению к лизосомам или удаляться из клетки. 3 – кавеолин-зависимый эндоцитоз (КавЗЭ) с участием рафтов плазматической мембраны, обогащенных холестерином и содержащих белок кавеолин (показано пунктиром). В процессе эндоцитоза отдельные кавеоли (Кав) объединяются в кавеосомы (Квс), далее материал доставляется в эндосомальный компартмент и аппарат Гольджи. Из аппарата Гольджи везикулы могут вновь транспортироваться на поверхность клетки для повторного использоваться в эндоцитозе.

105

3.2.1. Клатрин-зависимый эндоцитоз

КЗЭ наиболее хорошо изучен [793]. Он характерен для всех клеток млекопитающих и способствует проникновению в клетку различных белков и других молекул путем использования специфических рецепторов на поверхности клетки. Поэтому данный процесс часто называют рецепторопосредованным эндоцитозом. КЗЭ участвует в проникновении в клетку таких лигандов, как липопротеины низкой плотности, трансферрин, факторы роста эпителия, антитела и многие другие. Размер частиц, проникающих в клетку по пути КЗЭ, обычно не превышает 100 – 150 нм в диаметре. В процессе эндоцитоза участвует белок клатрин, прикрепленный к плазматической мембране со стороны цитоплазмы, а также целый ряд ассоциированных белков. Эти белки принимают участие в инвагинации мембраны и образовании окаймленных клатрином ямок (ОЯ), которые отделяются в цитоплазму в виде окаймленных клатрином везикул (ОВ). Большое значение в этом процессе играет способность клатрина образовывать сферическую структуру в форме корзинки (basket) вокруг эндосомы. Кроме того, в процессах перемещения материала участвует актин, который образует сеть вокруг ОЯ, формирует везикулы и образует нити для дальнейшего перемещения ОВ от поверхности клетки в глубь цитоплазмы [794,795]. В перемещении ОВ участвуют белки, принадлежащие к группе миозинов, которые одним концом прикрепляются к специфическим белкам на поверхности ОВ, а другим концом перемещаются вдоль нитей актина, используя энергию АТФ [796]. Большое значение в движении эндосом играют микротрубочки, которые обычно могут направлять движение эндосом от периферии клетки к центру организации микротрубочек (ЦОМ), находящемуся недалеко от ядра [797,798]. Примечательно, что движение в обратном направлении также возможно.

Захваченные на поверхности клетки частицы транспортируются в ранние эндосомы, находящиеся на периферии клетки и собирающие большинство везикул, отпочковывающихся от плазматической мембраны в цитоплазму [543,796]. Ранние эндосомы имеют трубчато-везикулярную морфологию с диаметром везикул до 1 мкм и диаметром трубочек около 50 нм. Ранние эндосомы являются органами сортировки веществ в клетке, способными направлять движение частиц в цитоплазме по нескольким путям. Так, частицы могут доставляться в рециклируемые эндосомы и возвращаться обратно на поверхность клетки посредством экзоцитоза, или, идя по другому, основному пути эндоцитоза, частицы перемещаются вглубь клетки и доставляются в поздние эндосомы. Поздние эндосомы являются одним из этапов перемещения частиц к лизосомам. К поздним

106

эндосомам может поступать материал не только из ранних эндосом, но также от аппарата Гольджи и фагосом. Поздние эндосомы являются также органами сортировки частиц, однако из этого компартмента значительная часть материала поступает к лизосомам. В лизосомах частицы подвергаются жесткому воздействию пищеварительных ферментов, работающих в кислых средах, что приводит к деградации белков, полинуклеотидов и липидов. При этом, по пути из ранних эндосом к лизосомам, среда постепенно закисляется от рН 6,0 в ранних эндосомах до рН 5,0-5,5 характерным для лизосом [799]. Лизосомы локализуются большей частью в глубине клетки недалеко от ядра (перинуклеарная область) и имеют диаметр

1 – 2 мкм.

Попадание лекарственных веществ, в особенности, генетического материала в лизосомы не желательно, поскольку это может привести к их быстрому разрушению. Поэтому используются различные приемы, позволяющие направить частицы по другим путям эндоцитоза, в которых снижена или отсутствует вероятность доставки частиц к лизосомам. Кроме того, делаются попытки высвобождения материала частиц из эндосомального компартмента до их попадания в лизосомы.

3.2.2. Фагоцитоз и макропиноцитоз

Фагоцитоз присутствует в специализированных клетках иммунной системы: дендритных клетках, макрофагах, моноцитах и нейтрофилах. На много более широко распространен близкий к нему процесс – макропиноцитоз, который иногда называют эндоцитозом жидкой фазы. Макропиноцитоз способен участвовать в захвате не только жидкости, но и крупных частиц, диаметром больше1 мкм. Как и в предыдущем случае, процесс начинается со связывания частиц на рецепторах, находящихся на поверхности клетки. Однако данный вид эндоцитоза является актин-зависимым и клатрин-независимым. В отличие от других видов эндоцитоза, данный процесс сопровождается образованием выпячивания плазматической мембраны на поверхности клетки, в центре которого образуется своеобразная манжета, работающая по механизму застежки-молнии (zipper) [800]. Захваченный материал попадает в большие везикулы, диаметром до 5 мкм, которые иногда называют макропиносомами. Дальнейший транспорт эндосом через цитоплазму происходит по пути, который, аналогично клатрин-зависимому эндоцитозу, может заканчиваться доставкой материала к лизосомам. В процессе движения эндосом к перинуклеарной области большую роль играют компоненты цитоскелета клетки, такие как актин, миозин и микротрубочки [801]. Поверхностные клеточные рецепторы, доставляющие вещества по этому пути, обычно попадают в лизосомы [802-807]. Однако в последние годы появился ряд свидетельств того,

107

что некоторые поверхностные белковые рецепторы, участвующие в процессе макропиноцитоза, могут не попадать в лизосомы и, следовательно, доставляют частицы в другие компартменты клетки, что существенно для сохранения активности многих веществ [808-810].

3.2.3. Кавеолин-зависимый эндоцитоз

Кавеолин-зависимый эндоцитоз характерен для большинства, хотя и не для всех, эукариотических клеток. Данный вид эндоцитоза менее изучен, чем описанные выше, несмотря на большое количество исследований и детальное описание микроскопической структуры кавеолей [811]. В процессе эндоцитоза участвуют области плазматической мембраны, обогащенные сфингозинами и холестерином, получившие название липидные рафты [812]. Эти области богаты рецепторными белками [812,813] и в исходном состоянии, вероятно, очень малы, что затрудняет их идентификацию [814]. Поэтому, существование рафтов в плазматической мембране является предметом жарких дискуссий [815]. Однако после прикрепления частиц к поверхности клетки, компоненты рафтов диффундируют в область взаимодействия с частицей, благодаря чему данные структуры можно идентифицировать. Там же скапливается белок кавеолин, прикрепленный к плазматической мембране со стороны цитоплазмы [816]. Это может приводить к инвагинации плазматической мембраны и к отделению в цитоплазму везикул – кавеолей, диаметром 50 – 100 нм, содержащих на цитоплазматической поверхности белки кавеолины нескольких видов. В каждой кавеоле может присутствовать до 144 молекул кавеолина [817], однако роль этих белков в процессе эндоцитоза не до конца понятна. Для формирования кавеолей необходимо присутствие белков кавео- лин-1 и кавеолин-2 которые, взаимодействуя друг с другом, образуют большой гетеро-олигомерный комплекс [818], собирающийся в аппарате Гольджи [819,820], а затем транспортируемый к плазматической мембране виде предшественника кавеоли [821,822]. Молекула кавеолина содержит домен, который предположительно ответствен за избирательное взаимодействие белка с холестерином и сфингомиелином [823], а также способен связывать сигнальные молекулы [824]. Так, животные, у которых отсутствовали некоторые формы кавеолина в результате нокаута соответствующих генов, сохраняли жизнеспособность и фертильность, хотя они страдали некоторыми патологиями мышечной, легочной систем и жирового обмена [825].

Кавеоли содержат ряд лигандов, которые участвуют в рецепции и эндоцитозе определенных молекул, включая фолиевую кислоту [826], альбумин [827], щелочную фосфатазу [828], а также некоторые патогены, включая токсин холеры [828] и некоторые вирусы [829]. Считается, что

108

кавеоли участвуют в разнообразных процессах клеточной сигнализации и транспорта сигнальных молекул [830-834]. Ряд заболеваний может быть связан с нарушениями кавеолярного эндоцитоза, включая рак, диабет, устойчивость к некоторым вирусным инфекциям [835]. В развитии кавео- лин-зависимого эндоцитоза большую роль играет актин.

Важно отметить, что при кавеолин-зависимом эндоцитозе частицы не транспортируются к лизосомам и, следовательно, не происходит деградации эндоцитируемых веществ. Хотя на представленной схеме кавеолинзависимый эндоцитоз показан, как обособленный путь, что призвано подчеркнуть отсутствие доставки эндоцитируемого материала к лизосомам, имеется ряд свидетельств того, что все пути сходятся на одних и тех же ранних эндосомах, где происходит селекция материала [836]. Более того, в процессе эндоцитоза по некавеолярному пути, материал может доставляться в кавеосомы [837].

Таблица 1. Примеры некоторых средств идентификации путей эндоцитоза [2].

Ингибиторы эндоцитоза частиц