3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

19

зависимость мицеллообразования от концентрации сурфактанта в воде. При низких концентрациях сурфактант находится в мономолекулярной форме, т.е. образует истинный раствор. Однако при повышении концентрации до некоторой величины начинают образовываться мицеллы (Рис.7). Эта концентрация (или область концентраций) называется критической концентрацией мицеллообразования (ККМ). Дальнейшее увеличение концентрации сурфактанта приводит к росту количества материала, находящегося в мицеллах, тогда как концентрация мономерной формы перестает расти и обычно сохраняется на постоянном уровне.

Рис.7. Зависимость мицеллообразования от концентрации сурфактанта. Критическая концентрация мицеллообразования – это пороговая величина концентрации сурфактанта (или некоторая область концентраций, обозначенная пунктирной линией), выше которой образуются мицеллы, а концентрация мономерной формы перестает расти

[70,81].

Величина ККМ различна для сурфактантов, принадлежащих к липидам биологических мембран, и сурфактантов, способных разрушать бислойную структуру и используемых в качестве детергентов. Так, ККМ мембранных липидов, например DPPC, равна 4,7ּ10-10 М, а холестерина – (2 – 4) ּ10-8 М, что на 4 – 6 порядков меньше, чем для детергентов [43,81]. При смешивании детергентов с фосфолипидами в соотношении, варьирующем для разных веществ в пределах детергент/фосфолипид = 0,5 – 2,0 происходит разрушение бислойной структуры и образование прозрачных суспензий смешанных мицелл, размеры которых слишком малы для рассеяния света. Поэтому внешне такие суспензии могут выглядеть как истинные мономолекулярные растворы. Некоторые детергенты способны взаимодействовать с гидрофобными белками и образовать мицеллы, благодаря чему белки «растворяются» в воде, сохраняя при этом нативную конформацию, что находит широкое применение в биохимии для выделения и очистки мембранных белков [72,82,83].

Мицеллы образуются в ограниченной области концентраций и температур, что хорошо видно на фазовых диаграммах (Рис. 8). Обычно на таких диаграммах величины ККМ образуют прямую линию, отделяющую область истинного мономолекулярного раствора сурфактанта от области, в которой присутствуют мицеллы (Рис. 8 А).

21

виды кристаллических структур. Характер образующихся структур в значительной мере зависит также от температуры. При низкой температуре сурфактанты плохо растворимы в воде и находятся в стоянии твердого геля, или образуют жидкие кристаллы. Чрезмерное нагревание также приводит к снижению растворимости некоторых сурфактантов, что приводит к помутнению суспензии вследствие агрегации мицелл. Соответственно, границы, отделяющие область существования мицелл называются нижней и верхней границами растворимости сурфактанта (Рис.8 А). Кроме того, при нагревании сурфактанта в условиях низкого содержания воды (высокой концентрации сурфактанта) происходит плавление геля и образование жидких кристаллов, к числу которых относятся гексагональные, кубические и ламеллярные фазы.

Фазовая диаграмма сурфактантов не всегда может характеризоваться единственной величиной ККМ. В зависимости от температуры и концентрации могут образовываться несколько типов мицеллярных структур и, соответственно, может быть несколько величин ККМ. Например, при гидратации CTAB с увеличением концентрации сурфактанта и изменением температуры могут образовываться сначала сферические, а затем цилиндрические мицеллы, которые образуются при разных величинах ККМ

(Рис.8 Б).

На фазовое поведение могут влиять и другие параметры раствора. Ионные сурфактанты могут быть чувствительны также к величине рН среды и присутствию ионов других веществ. Так, например, замена Br- на Cl- в суспензиях цетилтриметиламмония (т.е. замена CTAB на CTAC) приводит к тому, что цилиндрические мицеллы не образуются, а сферические мицеллы сохраняются до очень высоких концентраций. Это демонстрирует роль зарядовых взаимодействий в фазовом поведении сурфактанта [84]. Наиболее известным примером подобных процессов является влияние ионов кальция, магния и карбонатов (жесткость воды) на фазовое поведение таких анионных детергентов, как соли жирных кислот, входящих в состав мыла.

Важной характеристикой сурфактантов является также агрегационное число, характеризующее количество молекул сурфактанта в мицелле. Эта величина зависит от параметра упаковки молекул в мицелле и связана с формой молекул. Она может находиться в пределах от нескольких молекул (холиевые кислоты, саркозил) до более сотни молекул (Triton X- 100). Для большинства детергентов, используемых в биохимии, эта величина составляет несколько десятков [83].

1.1.6. Инвертированные фазы

При величине параметра Р > 1 молекулы липидов имеют форму конуса, что приводит к искривлению бислоя и слиянию соседних мембран с образованием структур, называемых сталками (Рис.9 Б, а). По мере роста

22

величины Р происходит увеличение числа сталков и их упорядочивание в кристаллические структуры, называемые биконтинуальными кубическими фазами (Рис.9 Б, б), которые более детально будут рассмотрены в следующих разделах этой главы. Дальнейшее увеличение кривизны приводит к формированию инвертированных трубочек, имеющих гексагональную упаковку на поперечном срезе. Эта структура называется гексагональной НII-фазой (Рис.9, Б, в).

Рис.9. Ряд лиотропных фазовых переходов липидов от ламеллярных структур, образуемых молекулами цилиндрической формы, к инвертированным мицеллам кубической фазы, образуемым молекулами конической формы. А – показаны липосомы, образованные бислойными мембранами, представляющими смектическую фазу. Б – последовательные стадии разрушения бислоя и формирования инвертированных мицеллярных структур по мере возрастания величины параметра упаковки Р (а – г).

23

Дальнейшее увеличение параметра Р приводит к фрагментации трубчатых структур и образованию инвертированных мицеллярных кубических фаз (Рис.9 Б, г), которые также будут рассмотрены более подробно. Внутри мицелл содержится вода, в которую экспонированы полярные головы липидов. Гидрофобные углеводородные цепи обращены наружу и окружены гидрофобной средой с низкой величиной диэлектрической проницаемости, которую условно можно назвать «маслом». Такой средой может быть органический растворитель. В этом случае образуется эмульсия мицелл, называемая «вода в масле». В эмульсиях, содержащих избыток воды, гидрофобные поверхности мицелл стремятся минимизировать взаимодействие с водой и агрегируют, образуя кристаллические структуры гексагональной или кубических фаз.

Появлению молекул конической формы и образованию инвертированных структур способствуют факторы, уменьшающие размер полярной головы, такие как пониженное содержание воды, что приводит к снижению размеров гидратной оболочки в полярной области, или нейтрализация заряженных групп, что приводит к уменьшению расталкивания одноименных зарядов полярных голов. Экспериментально показано, что отрицательно заряженные липиды, например, кардиолипин образуют инвертированные структуры в присутствии катионов металлов, особенно двухвалентных катионов кальция или магния [85-88]. Кроме того, анионные липиды фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, кардиолипин образуют инвертированные структуры при смешивании с катионными липидами [89-92]. Формированию липидов конической формы может способствовать также увеличение объема гидрофобной части молекул, что может наблюдаться при повышении температуры и увеличении подвижности углеводородных цепей. Так, фосфатидилэтаноламин претерпевает фазовый переход бислой – гексагональная НII фаза при повышении температуры [44,45].

Ряды фазовых переходов обычно наблюдается при изменении температуры и содержания воды в образцах, что позволяет построить фазовые диаграммы, на которых можно наблюдать области присутствия различных фаз. Всю указанную выше последовательность фаз можно наблюдать, например, в гомологическом ряду веществ, молекулы которых отличаются размером полярной головы, как это было показано на примере синтетических амфифилов [55]. Однако для большинства природных липидов не удается наблюдать всю последовательность структурных изменений. Каждое отдельное вещество обнаруживает лишь ограниченное число фазовых состояний (Рис.10 А). Кроме того, последовательность фазовых переходов может быть нарушена. Например, при нагревании DPPE происходит переход из ламеллярной фазы в гексагональную, минуя кубическую фазу, что вступает в кажущееся противоречие с базовой схемой последовательной смены фаз (Рис.10 Б).

24

Рис.10. Фазовые диаграммы дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) и дипальмитоилфосфатидилэтаноламина (DPPE) в воде [42]. Вдоль линии (1) наблюдается лиотропный ряд фазовых переходов из инвертированной гексагональной НII в инвертированную кубическую (QII) и в жидкую ламеллярную (Lα) фазу в процессе увеличения содержания воды в суспензии DPPC. Вдоль линии (2) видна широко известная для DPPC последовательность термотропных фазовых переходов из твердой кристаллической ламеллярной фазы (Lc’) в фазу ламеллярного геля с наклоном углеводородных цепей (Lβ’) – субпереход, далее в риппл-фазу (Pβ’) – предпереход, и в жидкую ламеллярную фазу (Lα) – главный фазовый переход (плавление липида). Вдоль линии (3) можно наблюдать последовательность термотропных фазовых переходов DPPE: Lc ↔ Lβ’ ↔ Lα ↔ НII. В этой последовательности отсутствует кубическая фаза при переходе из ламеллярной в гексагональную НII фазу, т.е. на стадии: Lα ↔ НII.

1.1.7. Разнообразие кубических фаз липидов

Разнообразие кубических фаз, образуемых липидами (Табл.2), становится особенно наглядным при их рассмотрении в трехмерном пространстве. Данные об их структуре получены, большей частью, на основе рентгеновской дифракции в малых углах. Рентгенограммы липидной массы или суспензии обычно дают хорошо различимые круговые рефлексы рассеяния рентгеновских лучей, на основании которых было описано семь различных пространственных групп кубических решеток, образуемых липидами. Наибольший вклад в обнаружение и кристаллографическое описание кубических фаз был сделан исследовательской группой Луззати

(Франция) [93-99].

25

Таблица 2. Лиотропные кубические фазы [42,51,100-102].

Идентификация пространственной группы свидетельствует лишь о положении узловых элементов решетки, но не говорит о тонкой структуре этих элементов, и о характере упаковки отдельных молекул липидов. Более детальный анализ рентгеновских изображений затруднен, поскольку, как уже отмечалось выше, в жидкокристаллических структурах отсутствует ближний порядок организации молекул. Хотя проведенный в дальнейшем электронно-микроскопический анализ некоторых фаз дал дополнительную информацию об их организации [103-105], наши знания о структуре этих фаз нельзя считать исчерпывающими.

Представления о структурной организации кубических фаз частично основаны на косвенных данных различных методов. Было обнаружено, что скорость латеральной диффузии молекул липидов существенно различаются в зависимости от типа кубической решетки [42,106-108]. Это позволяет предположить, что некоторые кубические фазы образованы отдельными мицеллами липида, при этом обмен молекул между мицеллами и, соответственно, диффузия молекул на большие расстояния существенно ограничены. Напротив, имеются кубические фазы, образованные непрерывной сетью искривленных плоскостей бислоя, вдоль которых происходит неограниченное молекулярное движение. Значительный вклад в представления об организации непрерывных фаз был сделан на основе математической теории бесконечных периодических минимальных поверхностей [109-113]. Такие поверхности характеризуются тем, что их суммарная кривизна в любой точке равна нолю. Нулевое значение возникает потому, что в каждой точке поверхности положительное значение кривизны (выпуклость) по одной из осей компенсируется отрицательным значением кривизны (вогнутость) по другой оси (Рис.11). Математическое описание данных поверхностей оказалось чрезвычайно полезным в

26

исследованиях структуры различных пористых и пенистых материалов, в том числе, и кубических фаз липидов [114].

Рис.11. Различные виды искривленных поверхностей. (а) – сферическая поверхность имеет выпуклость по двум осям: WX = WY > 0; (б) – цилиндрическая поверхность имеет выпуклость только по одной оси: WX > 0, WY = 0; (в) – минимальная поверхность: параметры кривизны по двум осям равны, но имеют противоположный знак, поэтому: WХ + WY = 0.

В настоящее время известно три бесконечные периодические минимальные поверхности: обозначаемые буквами Р, D и G, что соответствует кристаллическим решеткам: примитивная (primitive), алмаз (diamond) и гироид (gyroid). Предполагается, что математическое описание бесконечных периодических поверхностей дает представление о форме гидрофобной области искривленного бислоя липидов. Бислой разделяет два пространства, которые представляют собой две непрерывные сети каналов, заполненных водой и не контактирующих друг с другом. Поэтому такие кубические фазы липидов называют биконтинуальными – двунепрерывными (bicontinuous cubic phases). Напротив, мицеллярные фазы имеют множество изолированных водных пространств, заключенных внутри инвертированных мицелл. Соответственно, они получили название дисконтинуальные – прерывистые (discontinuous cubic phases).

Структура кубических фаз чрезвычайно сложна и графические изображения на плоскости дают лишь частичное представление об их пространственной организации. Поэтому разные авторы предлагают различные графические изображения фаз, в которых уделяется внимание разным аспектам их структуры (Рис.12). Более точные компьютерные изображения бесконечных периодических минимальных поверхностей биконтинуальных фаз основаны на использовании следующих формул

[115,116]:

Р – поверхность: cos(x) + cos(y) + cos(z) = 0

D – поверхность: sin(x)sin(y)sin(z) + sin(x)cos(y)cos(z) + cos(x)sin(y)sin(z) + cos(x)cos(y)sin(z) = 0

G – поверхность: sin(x) cos(y) + sin(y) cos(z) + sin(z) cos(x) = 0

27

Рис.12. Структура биконтинуальных кубических фаз. Биконтинуальные фазы изображены в виде бесконечных периодических минимальных поверхностей (А - В), находящихся в гидрофобной области липидного бислоя, или виде водных каналов, располагающихся внутри инвертированных трубочек липида (Г, Д). А – примитивная решетка, Р-поверхность, группа Im3m, аспект Q229; Б – решетка диаманд, D- поверхность, группа Pn3m, аспект Q224; В – решетка гироид, G-поверхность, группа Ia3d, аспект Q230. Показаны также водные каналы фаз Pn3m (Г), а также Ia3d (Д). Для лучшего понимания структуры фаз на рисунках даны также изображения молекул липидов.

Р-поверхность (Primitive), группа, Im3m, аспект Q229, иногда называют «кошмар сантехника» (Plumber's nightmare), хотя ее структура является наиболее простой. Элементарная ячейка содержит три взаимно перпендикулярные водных канала, которые соединяются со смежными ячейками, образуя кубическую решетку. Очевидно, что имеется две идентичных сети водных каналов, которые отделены бислоем липида.

D-поверхность (Diamond), группа Pn3m, аспект Q224, называемая «дьявольским наслаждением» (Devil’s delight), разделяет две идентичные и не связанные друг с другом сети водных каналов, образующих решетку алмаза. В каждом узле такой решетки встречаются четыре канала, под углом 109,5о, характерных для тетраэдра.

G-поверхность (Gyroid), группа Ia3d аспект Q230, вполне заслуживает названия Gerrymander’s walk, что в вольном переводе может звучать как: «походка хромого Джерри», и является наиболее сложной из известных в