3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

49

положении, но гидрофобный хвост моноолеата глицерина на 4 атома углерода длиннее. Более длинная цепь увеличивает объем гидрофобной области, что делает форму молекулы более клиновидной. Соответственно, в фазовой диаграмме моноолеата больше представлены инвертированные фазы (фазы второго типа). Так, область ламеллярных структур (Lα) уменьшается, но появляется область гексагональной Н2 фазы.

Рис.5. Фазовые диаграммы бинарных систем моноацилглицерин/вода [52]. Диаграммы даны для моноацилглицеринов, представленных выше (Рис.4). Lα – ламеллярная жидкая и Lc, – ламеллярные кристаллическая фазы; L2 – мицеллярная инвертированная фаза; Ia3d, Pn3m – биконтинуальные кубические фазы; H2 – гексагональная H2 фаза.

Рассмотрим теперь фазовые диаграммы моновакцената глицерина и моноэруцината глицерина (Рис.5 в, г). Эти молекулы во многих отношениях идентичны, но в последнем случае длина ацильной цепочки увеличена и, соответственно, сдвинуто положение двойной вязи, что уменьшает клиновидность молекул. Можно ожидать, что это приведет к сдвигу фазовой диаграммы в пользу фаз первого типа. Действительно, в фазовой

50

диаграмме моновакцената глицерина (Рис.5 б) площадь ламеллярных Lα и Lc фаз несколько увеличена по сравнению с площадью этих фаз на диаграмме моноолеата глицерина (Рис.5 в), однако, вопреки этому, сильно уменьшается площадь ламеллярной фазы L2 и возрастает площадь гексагональной Н2 фазы (Н2). Общее уменьшение ламеллярных фаз и рост гексагональной Н2 фазы еще более выражены в диаграмме моноеруцината глицерина (Рис.5 г), что свидетельствует о сдвиге в сторону, противоположную ожидаемой. Очевидно, что предсказания, сделанные только по форме молекул слишком упрощены и ненадежны. Кроме того, фазовые диаграммы этих липидов, представленные различными исследователями, могут сильно различаться. Например, в фазовой диаграмме моноеруцината глицерина могут преобладать ламеллярная фаза [277], кубическая фаза[278] или гексагональная Н2 фаза [279]. Однако позже были приложены усилия [275] для того, чтобы разрешить эти противоречия и была предложена уточненная диаграмма (Рис.5 г).

Характерный для моноацилглицеринов выраженный полиморфизм фазового поведения в котором доминируют кубические фазы известен лишь для немногих амфифилов [52,261,262,280]. Например, он был обнаружен на фазовых диаграммах фитантриола и глицерилфитанила, молекулы которых имеют некоторое сходство с молекулами моноацилглицеринов, но отличаются, прежде всего, наличием разветвленной фитаниловой (изопреноидной) цепи в гидрофобной части молекулы, что увеличивает ее объем. Благодаря этому молекула приобретает форму обратного конуса. Другой пример подобного фазового поведения веществ можно обнаружить в группе гликозид изопреноидов. Сложное фазовое поведение присуще лишь немногим веществам этой группы [261,281-284], например фитантриолу или β-ксилозил-фитонилу (Рис.6).

В практических целях важны также данные о параметрах решетки, толщине бислоя и диаметре водных каналов в кубосомах, что определяет размер веществ, которые могут быть инкапсулированы в этих фазах, а также влияет на скорость выхода веществ (Табл.1).

Таблица 1. Толщина бислоя и диаметр водных каналов для биконтинуальной кубической фазы Pn3m четырех различных моноацилглицеринов [52].

51

Как видно из таблицы, толщина липидного бислоя приблизительно в два раза превышает длину молекулы липида, и соответственно, толщина бислоя для липидов с длиной цепочки С18 больше, чем липида с длиной цепочки С14. Повышение температуры увеличивает конформационные флуктуации гидрофобных цепочек, что приводит к их укорочению и делает бислой тоньше. Предполагается, что диаметр водного канала должен коррелировать с предпочтительной кривизной бислоя, определяемой формой молекулы амфифила [286].

Рис.6. Структура и фазовые диаграммы некоторых амфифилов сходных с моноацилглицеринами [52]. (а) фитанил глицерил образует только гексагональную Н2 фазу (б) фитантриол способен к сложному фазовому поведению, как видно из представленной диаграммы; (в) β-мальтозил-фитонил – образует только ламеллярную Lα фазу; (г) β-ксилозил-фитонил – проявляет сложное фазовое поведение, как видно из приведенной диаграммы. Обозначение фаз такое же, как на диаграммах, представленных ранее (Рис.6).

Кривизна слоя связана с радиусом водного канала. Поэтому малые водные каналы соответствуют слоям с высокой кривизной. Повышение температуры и увеличение длины гидрофобных цепочек приводят к уменьшению диаметра водных каналов. Коническая форма молекул изменяется в ряду 14:1c7 > 14:1c9 > 18:1c9 > 18:1c11, что в целом коррелирует с уменьшением диаметра водных каналов кубических фаз этих амфифилов за исключением 18:1c11, который формирует аномально большие каналы. Размеры водных каналов уменьшаются при повышении температуры. Эта тенденция прослеживается также для размеров водных каналов гексагональной НII фазы, образуемой этими амфифилами. Так, диаметр водных каналов полностью гидратированного моноэруцинат глицерина (22:1c13) линейно уменьшается с увеличением температуры от 36 Å при

40 ºС до 23 Å при 120 ºС [275].

53

Это приводит к существенному уменьшению энтальпии фазового перехода и к разделению ламеллярных и кубических мезофаз при загрузке вещества первого типа выше некоторого максимального значения. Молекулы первого типа также препятствуют образованию кубосом, обладающих внутренней упорядоченной структурой. При этом, образуются везикулы и, так называемая, губчатая фаза – структура с более низкой степенью упорядоченности, чем кубическая фаза. Вещества второго типа, например фитостеролы или коэнзим Q10 , локализуются в глубине гидрофобной области, и оказывают значительно меньшее воздействие на фазовое поведение липидов. Даже при превышении максимальной загрузки при концентрациях, когда избыток лекарственного вещества выпадает в осадок, не происходит существенного изменения формы кубосом.

Высокая вязкость гексагональной и кубической фаз могут ограничивать их использование в некоторых областях медицины [264]. Для преодоления этих проблем объемные мезофазы можно диспергировать для получения малых эластичных частиц (кубосом или гексосом), которые могут сохранять внутреннюю структурированность и некоторые другие важные свойства исходного материала [297,298]. Однако диспергирование кубических и гексагональных липидных систем до размеров наночастиц часто требует длительной и очень интенсивной обработки, а размеры образующихся частиц могут сильно варьировать. Для облегчения процедуры получения мезофаз с низкой вязкостью и для и сокращения времени суспендирования к липидам можно добавлять спирт и следовать определенной процедуре разведения в растворителе [299]. Эта процедура позволяет получать гомогенные частицы, размером 100 – 500 нм с улучшенными параметрами стабильности. Улучшение процедуры приготовления было достигнуто также с использованием смесей полипептидных сурфактантов [298] или предварительным получением порошкообразных частиц, высушенных в присутствии декстрана и крахмала. Распространение получило также использование стабилизаторов, например плуроника или полок-

самера (Pluronic F-127, Poloxamer 407), представляющими триблок-

сополимеры, образованные полиэтиленоксидом и полипропиленоксидом [300]. Было показано, что при низкой концентрации полоксамера 407 большая часть полимера находится на поверхности частиц, что обеспечивает стерическое препятствие для их агрегации. Недавно было показано, что в системе: моноолеат глицерина – этанол – вода также может образоваться суспензия мелких кубосом QL с пространственной симметрией решетки Pn3m [301]. Низкая вязкость полученной фазы делает ее удобной для создания эластичных наночастиц пригодных для загрузки лекарственных веществ.

54

2.2.2. Токсичность кубосом из моноолеата глицерина

Кубосомы, содержащие моноолеат глицерина, нельзя использовать для инъекций, поскольку они проявляют гемолитическую активность при инкубации с суспензией эритроцитов (Рис.8 а). Он также может оказывать негативное воздействие на выживаемость некоторых видов клеток культуры тканей (Рис.8 б). Кроме того, моноолеат глицерина токсичен при внутримышечном введении, поскольку вызывает сильный воспалительный процесс.

Рис.8. Взаимодействие кубосом из моноолеата глицерина с живыми клетками [302]. (а) – гемолитичекая активность кубосом (черные кружки) и эмульсии из соевого масла и яичного фосфатидилхолина 1:5 (белые кружки). (б) – Выживаемость клеток Coco-2 при инкубации с кубосомами, которые добавляли в культуральную среду. Время инкубации клеток с кубосомами – 1 день при 37ºС.

Однако моноолеат глицерина нетоксичен при пероральном введении и нанесении на поверхность кожи. Он широко используется в качестве эмульгатора в пищевой промышленности и косметике, где это вещество считается безопасным, биосовместимым и биодеградируемым [303,304]. Благодаря этому, фармацевтическое использование моноолеата глицерина постоянно расширяется [304].

2.2.3. Высвобождение веществ из кубосом

Кубосомы из моноолеата глицерина способны инкапсулировать как водорастворимые, так и гидрофобные вещества. Они обладают огромной поверхностью: 300 – 400 м2/г кубической фазы, что ускоряет обмен заключенных в кубосомах веществ с окружающей средой. Кубосомы могут

55

успешно использоваться для инкапсулирования плохо растворимых в воде или токсических веществ которые могут медленно высвобождаться из кубосом. К настоящему времени в кубической фазе заключали самые разнообразные агенты (Табл. 2).

Таблица 2. Примеры веществ различной полярности и молекулярной массы, которые были инкорпорированы в кубической фазе [305].

Эксперименты по высвобождению лекарственных веществ из кубосом, полученных на основе моноолеата глицерина, показали, что для малых и сравнительно хорошо растворимых в воде молекул кубосомы не создают барьера и не способны их инкапсулировать. В случае гидрофобных молекул кубосомы способны задерживать их высвобождение. Инкапсулированные белки и макромолекулы могут вообще не высвобождаться из кубосом, что зависит от размера самих молекул и размера ячеек кубической фазы. Например, показателен эксперимент, в котором кубосомы загружали различными веществами и полученную суспензию помещали в диализную ячейку для наблюдения скорости высвобождения этих веществ [302]. Скорость выхода метиленового синего из кубосом и чистого раствора была одинаковой (Рис.9). Таким образом, это хорошо растворимое в воде вещество можно было использовать в качестве контроля.

Выход бромокрезола из кубосом был существенно замедлен по сравнению с выходом из водного раствора. За 5 часов из кубосом высвобождалась только половина от всего количества этого агента, тогда как из водного раствора все вещество выходило за 2 часа. Еще большая задержка наблюдалась для рифампицина. За 20 часов высвобождалось только 30% этого вещества, тогда как из водного раствора все вещество высвобождалось за 3 часа. Такие различия между бромокрезолом и рифампицином можно объяснить различиями их гидрофобности и способности взаимо-

56

действовать с кубосомами. В случае инсулина за 5 часов высвобождалось около 20% . После этого кривая выходила на плато и дальнейшего высвобождения не наблюдалось. Можно предположить, что в начальный период происходил выход той части инсулина, которая не взаимодействовала с кубосомами и находилась в растворе в свободном состоянии. Та часть инсулина, которая находилась внутри кубосом, не высвобождалась совсем. Это показывает насколько затруднен выход больших белковых молекул из кубосом.

Рис.9. Высвобождение [302] метиленового синего, бромокрезола, рифампицина и инсулина из водного раствора (черные кружки) и из кубосом (белые кружки).

2.2.4. Кристаллизация белков в кубических и губчатых фазах

Получение кристаллов мембранных белков, пригодных для рентгеноструктурного анализа, – чрезвычайно трудная задача. Классический подход, заключающийся в использовании детергентов для получения растворов этих белков, может приводить к существенным нарушениям упаковки аминокислотных цепей, снижению активности ферментов и даже к денатурации. Для стабилизации белков необходим тщательный подбор детергентов. Кроме того, к детергенту приходится добавлять некоторые липиды, способные поддерживать нативную структуру молекулы белка, что может способствовать получению кристаллов [306,307].

Альтернативным подход заключается в реконструкции очищенных мембранных белков в кубическую фазу липида. Было показано, что для этих целей пригодны только биконтинуальные кубические фазы, в которых могут диффундировать гидрофобные мембранные белки и происходить рост кристаллов [308]. Наибольшего успеха удалось достичь при использовании моноолеата глицерина. Хотя процесс кристаллизации бел-

57

ков в кубической фазе липида до сих пор плохо изучен, этот подход был успешно применен на некоторых белках, включая бактериородопсин [309,310], галородопсин [311], зрительный родопсин [312-314], бактериальный фотосинтетический реакционный центр [315,316], переносчик кобаламина BtuB [285] и β2-адренергический рецептор [317,318].

Вследствие прозрачности и изотропности кубических структур в них можно наблюдать растворенные вещества с использованием различных методов спектроскопии. Так, спектроскопические свойства заключенного в кубическую фазу α-химотрипсина не отличались от водного раствора этого белка [319]. Спектры кругового дихроизма показывали, что конформация белка практически не изменялась. Сохранялась и ферментативная активность, хотя кинетика была более медленной. Кроме того, не изменялись также реологические свойства кубической фазы моноацилглицеринов после инкорпорирования α-химорипсина. Кубические фазы также способны поддерживать нативную конформацию гидрофобных белков и полипептидов, таких как бактериородопсин, мелиттин или фото-

синтетический реакционный центр из Chloroflexus aurantiacus [320,321].

Однако использование кубических фаз связано с рядом трудностей. Диффузия в них слишком мала, в связи с высокой вязкостью, а диаметр водных каналов не достаточно велик для размещения мембранных белков с большим размером гидрофильного домена. Кроме того, в некоторых случаях кубическая фаза недостаточно прозрачна, что затрудняет поиск и «вылавливание» готовых кристаллов [322].

Недавно был достигнут существенный прогресс в кристаллизации гидрофобных белков с использованием губчатой фазы липида или L3 фазы, которая отличается от кубической фазы меньшей упорядоченностью (или отсутствием упорядоченности) кристаллической решетки и меньшей вязкостью [323]. Авторам удалось создать систему скрининга для кристаллизации мембранных белков, состоящую из 48 вариантов губчатой фазы липида. Эта фаза может быть получена на основе кубической фазы моноолеата глицерина путем добавления в среду полиэтиленгликоля, или некоторых других полимеров в процессе набухания липида. В полученной губчатой фазе размер пор в три раза больший, чем в соответствующей кубической фазе, что позволяет исследовать мембранные белки со значительно большим размером гидрофильного домена. Важно также то, что губчатая фаза липида на много менее вязка, чем кубическая, сохраняет текучесть при комнатной температуре и может использоваться для выращивания кристаллов с применением классических подходов, например, методом подвешенной капли. Использование губчатой фазы позволило получить кристаллы таких мембранных белков, как фотосинтетический реакционный центр [324], светособирающий комплекс и бактериальный транспортный белок [325,326]. Более того, применение системы скринин-

58

га позволило достичь существенного прогресса в кристаллизации ряда новых белков, что свидетельствует об эффективности этого подхода

[323]

2.3. Твердые липидные наночастицы

Твердые липидные наночастицы (ТЛН) были впервые созданы Мюллером и соавторами в середине 90-х годов [327]. Они являются перспективной альтернативой другим видам липидных частиц, включая липосомы, и получают все большее распространение [246,250,328-332]. ТЛН представляют собой коллоидные наночастицы, содержащие биосовместимые, биодеградируемые липиды, такие как фосфолипиды, холестерин, триглицериды, жирные кислоты, воски, температура плавления которых выше температуры тела и поэтому, при введении в организм, они находятся в твердом состоянии. Обладая размерами 100 – 400 нм, ТЛН способны инкапсулировать не только гидрофобные, но также гидрофильные лекарственные вещества и диагностические агенты, способны защищать заключенные в них вещества от действия неблагоприятных факторов окружающей среды, препятствуя химической, фотохимической и окислительной деградации, обеспечивают длительное и равномерное высвобождение лекарств. Их преимуществом является также простота и дешевизна производства в промышленных количествах [246]. ТЛН представляют широкие возможности для различных видов использования, включая парентеральное и пероральное [253,329,333,334]. Они также могут успешно применяться для нанесения на поверхность кожи [252,330,335,336], для доставки лекарств в легкие и глаза [337-341]. К настоящему времени первые немногочисленные препараты на основе ТЛН допущены к применению в различных областях медицины. Так, торговая марка SLP™ (solid lipid nanoparticles) зарегистрирована в области фармакологии, а также данный продукт под названием Lipopearls™ зарегистрирован в косметике (Adina, Великобритания) [247].

Вскоре после создания ТЛН были предложены усовершенствования, позволяющие расширить область применения липидных частиц. Например, добавление к твердым липидам некоторого количества жидких липидов позволило получить, так называемые, наноструктурированные липидные переносчики (НСП). Для транспортировки лекарственных веществ, плохо растворимых в липидах, были предложены также конъюгаты лекарства и липида (КЛЛ) [247,252,329,333], которые стали торговыми мар-

ками SLN™ (Solid Lipid Nanoparticles), а также NLC™ (nanostructured lipid carriers).