3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

69

было показано преимущество наличия цисдвойной связи в девятом положении цепи С18, как в олеиновой кислоте [451,453-455].

Липиды, содержащие разные по длине или степени насыщенности углеводородные цепи, асимметричные липиды, иногда проявляют большую активность, чем симметричные [456]. Данное наблюдение было сделано, независимо в нескольких лабораториях на липидах, обладающих высокой степенью асимметрии углеводородных цепей: С18:1 и С12:0 [457], а также С18:1 и С10:0 [455]. В то же время по данным других авторов симметричные липиды обнаруживали большую или такую же активность, как асимметричные [452,458].

Проводились также многочисленные исследования роли длины углеводородных цепей [445,448,453,454,459-466]. Длина цепей в различных исследованиях обычно находилась в пределах С10 – С18. Насыщенные липиды с очень короткой цепью С10 – С12 обнаруживали токсическое действие, но при этом в смеси с более длинноцепочечными липидами могли существенно увеличивать трансфекцию [455,467]. В целом, для насыщенных липидов наилучшие результаты были получены при длине цепочек в интервале С12 – С14. Примечательно, что по данным некоторых исследователей короткие цепи благоприятны для трансфекции in vitro, тогда как in vivo лучшие результаты можно получить при использовании более длинных ненасыщенных цепей, прежде всего С18:1 [466,468].

Существенное влияние на активность катионных липидов может оказывать фторирование гидрофобной части молекул. Так, фторированные глицерофосфоэтаноламины могут служить в качестве хелперов, существенно превосходящих DOPE [469]. Фторирование углеводородных цепей катионных липидов DOSPA, DOGS и катионного детергента также позволило повысить их активность в трансфекции [469-472].

2.4.2. Структура и свойства липоплексов

ДНК инициирует существенные структурные изменения в катионных липосомах. Предполагается, что электростатические силы ответственны за взаимодействие ДНК с поверхностью липидного бислоя [473], агрегацию и коллапс липосом [474]. Возникающая при этом структура зависит от многих факторов. Существенное влияние на структуру может оказывать соотношение ДНК/липид или размер липосом, используемых для приготовления липоплекса. Так например, избыток ДНК препятствует слиянию малых катионных липосом, но при взаимодействии с большими моноламеллярными катионными липосомами в присутствии ДНК происходит слияние мембран и образование гигантских мультиламеллярных комплексов (Рис.14 а, б).

70

Рис.14. Структурная организация некоторых видов липоплексов. Электронная микроскопия ультратонких срезов липоплексов приготовленных путем добавления раствора ДНК к суспензии липосом из катионного фосфатидилхолина (EDOPC) при быстром перемешивании. (а) – малые моноламеллярные липоплексы, полученные смешиванием малых монослойных везикул катионного фосфатидилхолина с избытком ДНК из спермы сельди (ДНК : липид = 2 : 1); (б) – гигантские мультиламеллярные липоплексы, полученные в тех же условиях, но при смешивании ДНК с большими моноламеллярными липосомами; (в) – мультиламеллярные липоплексы, полученные, как в препарате « а», но при избытке липида (ДНК : липид = 1 : 2).

Рис. 15. Молекулы ДНК после адсорбции на поверхности катионных липосом – (а) могут функционировать как молекулярный клей и инициировать агрегацию везикул с образованием стопок – (б), или инициировать существенную трансформацию в организации липида, в результате которой возникают различные структуры, включая плоские стопки бислоев между которыми находятся молекулы ДНК, ориентированные параллельно друг-другу – (в), мультиламеллярные везикулы – (г) или пучки инвертированных трубочек липида, образующих гексагональную HII фазу – (д). Во всех случаях ДНК находится внутри липидных структур и может способствовать их стабилизации.

71

Слияние малых липосом и образование мультиламеллярных липоплексов наблюдается также при добавлении избыточного количества липида к раствору ДНК (Рис.14 в). Влияние на структуру и свойства липоплексов таких факторов, как липидный состав, суммарный заряд и процедура приготовления описано в ряде исследований [475-477]. Примечательно, что молекулы ДНК, адсорбированные на поверхности фосфолипидного бислоя или заключенные между бислоями в мультиламеллярных структурах, образуют кластеры параллельно ориентированных нитей, которые под электронным микроскопом выглядят, как отпечатки пальцев

[478,479].

Присутствие упорядоченных молекул ДНК между бислоями липида было также подтверждено рентгеновским рассеянием в малых углах [480484]. По мнению некоторых исследователей, организация ДНК в липоплексах сравнима с псевдо кристаллической упаковкой вирусной ДНК

[485,486].

Простейшим примером структуры липоплекса является стопка везикул склеенных молекулами ДНК (Рис.15 б). Наиболее часто встречающиеся мультиламеллярные структуры (Рис.15 в,г) могут возникать в результате существенной реорганизации липидного бислоя [477,479,485,487,488], разрушения бислойных везикул и формирования, специфических интермедиатов слияния мембран [489,490], проникновения ДНК внутрь везикул и взаимодействия ДНК с обеими сторонами липидного бислоя [491]. Кроме мультиламеллярных структур, липиды могут образовывать трубчатые структуры [492] с молекулой ДНК, располагающейся внутри трубочек (Рис.15 д). Такие структуры, названные «спагетти» [493] могут сосуществовать с мультиламеллярным липоплексом или выступать наружу из липоплексов, образуя структуры, напоминающие кнопку (map-pin) [494]. ДНК может располагаться также внутри инвертированных трубочек (Рис.15 Е) гексагональной HII фазы липида

[481,484,495-497].

При образовании липоплекса могут изменяться также физические свойства липидов. Так, температура плавления липидов может как возрастать, так и снижаться в различных липоплексах [498-500]. Стабильность и температура денатурации ДНК также может существенно возрастать вплоть до 105-115ºС в результате взаимодействия с мультиламеллярными поверхностями катионного липида [501,502]. Конформационные изменения в ДНК, обозначаемые как Ψ¯ДНК, обнаруживаются также с помощью кругового дихроизма [503]. Появление Ψ¯ДНК зависит от соотношения зарядов и структуры липида. Следует однако, отметить, что корреляции между возникновением Ψ¯ДНК и активностью в трансфекции не было обнаружено.

72

Физические свойства липоплексов, определяемые в основном упаковкой ДНК и липида, могут влиять на эффективность трансфекции. Было предположено, что суммарный заряд и плотность заряда могут коррелировать со стабильностью липоплексов и активностью в трансфекции [504]. В некоторых экспериментах трансфекционная активность липоплексов, образующих гексагональную HII фазу, была выше, чем липоплексов, образующих бислой [438,481-484,486,505,506]. Однако, как было показано в других исследованиях, преимущество липидов, образующих гексагональную HII фазу, во многих не обнаруживается [476,503,507]. Существенное увеличение трансфекции достигалось также в липидных смесях с различной длиной углеводородных цепочек, или различными полярными головами [508-510]. Как было показано недавно, активность в трансфекции коррелирует со способностью смесей липидов к переходу гель – жидкий кристалл при физиологических температурах [47], или со способностью липоплекса обмениваться липидом и сливаться с мембранами клетки и, в результате этого, продуцировать небислойные полиморфные структуры, включая кубические фазы [455,511-514].

2.4.3. Взаимодействие липоплексов с клеткой

Предполагается, что адсорбция липоплексов на клеточной поверхности определяется электростатическим взаимодействием между катионными липидами липоплексов и отрицательно заряженной поверхностью клетки. Во взаимодействии могут участвовать сульфаты протеогликанов, вносящие основной вклад в отрицательный заряд клеточной поверхности [515]. Сиаловые кислоты могут также вносить вклад в отрицательный заряд клеточной поверхности и участвовать в адсорбции частиц, имеющих катионные сайты [516]. Кроме того, плазматическая мембрана содержит некоторое количество отрицательно заряженных липидов, которые могут влиять на взаимодействие липосомальных препаратов с клеточной поверхностью [517].

Хотя предполагается, что суммарный положительный заряд липоплексов необходим для взаимодействия с клеточной поверхностью, соотношение между эффективностью трансфекции и зарядом липоплексов не простое. В зависимости от соотношения липид/ДНК значительная часть положительного заряда липида нейтрализуется отрицательным зарядом полинуклеотида, что приводит к снижению или даже инверсии зетапотенциала липоплексов [518], который экспериментально определяется по электрофоретической подвижности частиц. Для достижения наибольшего уровня трансфекции зета-потенциал, должен быть слабо положительным, хотя трансфекция может быть высокой также при слабо отрицательных значениях зета-потенциала [519,520].

73

Размер липоплексов может влиять на пути их интернализации в клетку и эффективность трансфекции [521,522]. Существует корреляция между размером липоплексов и величиной зета-потенциала. Размер липоплексов возрастает при малых значениях зета-потенциала поскольку отсутствуют силы электростатического расталкивания, способные препятствовать агрегации и слиянию частиц. Оптимальный размер липоплексов варьирует в различных исследованиях. Для липоплексов, содержащих катионный холестерин, оптимальный размер находится в пределах 0,4 – 1,4 µ [523,524]. Сходный размер был оптимален также для липоплек-

сов, содержащих DOTAP [525,526].

В большинстве случаев после адсорбции на поверхности клетки липоплексы проникают внутрь клетки посредством эндоцитоза [408,422,527531]. В результате инвагинации плазматической мембраны липоплекс оказывается внутри эндосомы [422,527-535], которая может перемещаться в перинуклеарную область с участием микротрубочек [536,537]. Известно, что пути интернализации различных частиц определяют дальнейшее направление их транспортировки и расположение в цитоплазме, доставку в лизосомы и, соответственно, возможность их энзиматической деградации. Пути через клатрин-зависимый эндоцитоз, макропиноцитоз или фагоцитоз ведут к лизосомам, тогда как пути через кавеолин-зависимый эндоцитоз позволяют избежать доставку частиц к лизосомам [537-539]. Хотя в ряде исследований было показано, что интернализация липоплексов происходит в основном посредством клатрин-зависимого эндоцитоза [51,528,534,539-542], представляется заманчивым исследование возможности высвобождения ДНК до момента доставки липоплексов в лизосомы, или направления липоплексов по путям, исключающим доставку в лизосомы [412,543].

Было разработано несколько способов предотвращения доставки липоплексов к лизосомам. Положительный результат достигался как путем разрушения, так и путем стабилизации микротрубочек, поскольку в обоих случаях затруднялась доставка липоплексов лизосомам [536,544]. Как было показано с помощью конфокальной микроскопии, после дезагрегации микротрубочек липоплекс не транспортировался в перинуклеарную область и оставался на периферии цитоплазмы, где могло происходить высвобождение ДНК. Однако высвобождение ДНК на периферии цитоплазмы может существенно увеличить время доставки ДНК к ядру, что приводит к возрастанию риска деградации ДНК под действием цитоплазматических ферментов. Медленная диффузия больших молекул в цитоплазме объясняется эффектом молекулярного скучивания [545,546]. Для молекул ДНК больших, чем 2000 bp скорость диффузии в цитоплазме была в 100 раз меньшей, чем в воде [547].

74

Как было отмечено выше, в норме липоплексы доставляются к лизосомам и скапливаются в перинуклеарной области. В этом случае быстрое высвобождение ДНК в цитоплазму является одним из важнейших условий эффективной трансфекции [548,549]. Лизосомотропные вещества, такие как хлорохин и его производные, или поливинилпирролидон, которые препятствуют снижению рН и активации литических ферментов, могут использоваться для защиты ДНК и повышения уровня трансфекции [550552]. Вещества, способные увеличивать осмотическое давление внутри лизосом, как например, сахароза [551], или некоторые поликатионные вещества, функционирующие, как протонная губка [553,554], могут вызывать набухание и разрыв лизосом, что способствует выходу ДНК в цитоплазму прежде, чем она может быть разрушена ферментами. Другое остроумное решение заключается в разработке «настраиваемых» (tunable) липосом, которые способны высвобождать ДНК при снижении рН [555,556]. Было показано, что указанные липосомы высвобождают ДНК вследствие перехода бислой – гексагональная HII фаза и активирования процессов слияния мембран при низких рН.

2.4.4. Дезинтеграция липоплексов анионными липидами

ДНК должна освободиться от липидного окружения для выполнения биологических функций. Высвобождению ДНК может способствовать нейтрализация заряда катионных липидов с помощью анионных липидов, присутствующих в клетке. В начале эти явления были исследованы в модельных экспериментах с анионными липосомами [557-559]. Было обнаружено, что ДНК может высвобождаться в условиях полной нейтрализации положительного заряда. Липидный состав как липоплекса, так и клеточных мембран может влиять на фазовое поведение смеси липидов отвечать за высвобождение ДНК [514].

Анализ формы молекул липидов позволяет предложить простое объяснение фазовому поведению смесей анионных и катионных липидов. Силы расталкивания, возникающие между одноименными зарядами (Рис. 16), увеличивают расстояние между полярными головами и этот фактор необходимо учитывать при определении формы молекул липида и внутренней кривизны слоя липидов. В смеси катионных и анионных липидов силы расталкивания между полярными головами сменяются силами притяжения. Это может рассматриваться как изменение формы молекул липида и соответствующее изменение внутренней кривизны слоя липидов. Уменьшение поверхности полярных липидов и увеличение внутренней кривизны благоприятствует проявлению полиморфизма липидов и формированию кубических или гексагональной HII фаз. Таким образом, если, например, анионный или катионный липиды в отдельности продуцируют большие бислойные везикулы, после смешивания липидов могут появить-

75

ся неламеллярные структуры с большой внутренней кривизной

[90,506,508,560].

Рис. 16. Корреляция между суммарным зарядом липидов, формой молекул и образуемыми структурами. (а,б) – при избытке положительного или отрицательного зарядов форма молекул липидов может быть аппроксимирована к цилиндру. При этом образуются плоские бислойные структуры. (в) – в смеси анионных и катионных липидов силы расталкивания между полярными головами липидов заменяются силами притяжения, а форма молекул может быть аппроксимирована к конусу. Молекулы конической формы склонны образовывать инвертированные сферические или трубчатые мицеллы, принадлежащие кубической или гексагональной HII фазам.

Рис.17. ДНК не может высвободиться из топологически замкнутых мультиламеллярных структур – а. Для высвобождения ДНК необходимы существенные преобразования липида, которые приводят к появлению топологически открытых структур, возникающих при слиянии мембран и образовании сталков – б, или формировании биконтинуальных кубических фаз – в.

Выход ДНК может зависеть от топологии липоплексов. Топологически закрытые структуры, как например, мультиламеллярные везикулы, препятствуют выходу ДНК (Рис.17) даже если взаимодействие ДНК с бислоем катонных липидов ослабеает вследствие нейтрализации положительного заряда. Для выхода ДНК в окружающее пространство барьер

76

бислоя должен быть нарушен. В случае мультиламеллярной структуры липоплекса дезинтеграция может начаться с образования межмембранных контактов, слияния мембран и образования межмембранных мостиков (сталков), что отражает начало полиморфных фазовых переходов [184,561-564]. Высвобождение ДНК коррелирует с внутренней кривизной смесей липидов и наилучший результат необходимо ожидать в смесях липидов в которых происходит наиболее полная дезинтеграция везикулярной структуры липоплекса. Корреляция между слиянием мембран и эффективностью трансфекции была показана в ряде лабораторий [565,566]. Недавно было также показано, что в смесях липидов существует корреляция между кривизной слоя, интенсивностью слияния между катионными и анионными липосомами, скоростью высвобождения ДНК и эффективностью трансфекции [455,511,514].

После адсорбции липоплексов на поверхности плазматической мембраны между липоплексом и клеткой начинается обмен липидом. Влияние обмена липидом на процесс эндоцитоза было показано во многих лабораториях [407,541,567-569]. Можно предположить, что обмен липидом влияет на процесс инвагинации мембраны, процесс обособления эндосомы и, таким образом, может определять пути эндоцитоза и, соответственно, направление транспортировки эндоцитируемого материала. Липидные наночастицы обычно проникают в клетки посредством клатринзависимого эндоцитоза и доставляются к лизосомам, где возможно разрушение плазмидной ДНК [528,534,539-542]. Напротив, если обмена материалом с плазматической мембраной не происходит, как, например, в случае эндоцитоза твердых шариков из катионного полимера, превалирует кавеолин-зависимый эндоцитоз [522,538,539]. Однако, не все липоплексы способны обмениваться липидом с плазматической мембраной [482,527,542]. Обмен липидами не обнаружен в случае эндоцитоза липоплексов с большой полярной головой и множеством катионных зарядов, что делает эти липиды сходными с катионными полимерами [482,570,571]. Перспектива контролирования путей эндоцитоза путем изменения состава липоплексов представляется очень привлекательной.

После проникновения в эндосомы, липоплексы обмениваются липидом с окружающей их мембраной [524,572]. Клеточные мембраны обычно содержат 10 – 20% отрицательно заряженных липидов, включая фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол [573]. Количество анионных липидов, присутствующих в мембране эндосомы, не достаточно для нейтрализации многочисленных бислоев липоплексов в которых присутствует 50 – 100% катионного липида. Эндосомы, содержащие липоплексы, взаимодействуют с различными цитоплазматическими мембранами и обмениваются с ними липидом вплоть до полной нейтрализации положительного заряда, что является важным условием высвобождения ДНК. Многочисленные

77

контакты между эндосомами и мембранами митохондрий, эндоплазматического ретикулума и ядра можно наблюдать с помощью электронного микроскопа (Рис.18). Как оказано на рисунке, находящиеся в цитоплазме липоплексы вступают в контакты с различными мембранными органеллами, включая митохондрии и ядерную мембрану. После разрушения липоплексов конфокальная микроскопия обнаруживает распространение катионного липида и ДНК во всей цитоплазме. При этом, лишь малая часть ДНК и липида липоплекса попадает в ядро [511].

Рис. 18. Электронная микроскопия культуры клеток эндотелия плаценты человека, обработанные липоплексом, содержащим плазмидную ДНК и смесь катионных фосфатидилхолинов EDOPC/EDLPC (6:4). А – липоплексы (ЛП) находятся в цитоплазме и взаимодействуют с митохондриями (МХ). Б – липоплекс взаимодействует с ядром (Я) и контактирует с ядерной мембраной с образованием мостика (Б’). В – показан еще один пример взаимодействия липоплекса с ядерной мембраной. Масштабная черта 0,5 мкм.

2.4.5. Пути проникновения ДНК в ядро

Описанные выше стратегии доставки ДНК в цитоплазму не достаточны для достижения высокого уровня трансфекции, поскольку основным лимитирующим фактором является процесс проникновения ДНК в

78

ядро. Малые полинуклеотиды, такие как антисмысловые ДНК, могут накапливаться в ядре в течение нескольких десятков минут. Напротив, плазмидная ДНК проникает в ядро очень медленно. Обычно плазмидная ДНК может появиться в ядре через 12 – 24 часов после обработки клеток [529,574]. В делящихся клетках уровень трансфекции обычно выше и коррелирует с митозом, при котором происходит разрушение ядерной оболочки [575-578]. Однако было показано, что даже в делящихся клетках ДНК может проникать в ядро не только в течение митоза, но и в интервалах между делениями клеток [579]. Хотя уровень трансфекции делящихся клеток обычно выше, чем неделящихся (например, нейронов), последние также подлежат трансфекции [580], что предполагает проникновение ДНК через интактную ядерную оболочку [581].

Более того, предполагаемое проникновение липоплекса в нуклеоплазму в процессе митоза вряд ли может повысить уровень экспрессии ДНК, поскольку этот параметр оставался очень низким даже после непосредственного введения липоплекса в ядро. Напротив, после введения обнаженной ДНК в ядро, уровень экспрессии был в 100 – 1000 раз выше, чем после введения ДНК в цитоплазму [582]. Это предполагает, что в норме ДНК должна высвобождаться из липоплекса в цитоплазме, а потом обнаженная ДНК должна проникать в ядро. В процессе перемещения через цитоплазму обнаженная ДНК подвергается ферментативному разрушению и менее 1% оставшейся интактной ДНК способно к экспрессии [583,584]. Предполагается, что ДНК может проникать в ядро в результате взаимодействия липоплексов с ядерной мембраной и нарушения целостности барьера ядерной мембраны вследствие слияния с липоплексами и образования мостиков или сталков, или ДНК может высвобождаться в цитоплазму, а затем проникать в ядро через ядерные поры (Рис. 19).

Каждое ядро имеет несколько тысяч пор [585], образованных белка-

ми комплекса ядерных пор (NPC nuclear pore complex) [586,587]. Как было показано с помощью электронной микроскопии, диаметр пор составляет около 40 – 45 нм, а длина около 90 нм [588]. Соответственно, макромолекулы с диаметром 39 нм [589] или ДНК около 300 bp могут проникать через поры [590], тогда как размер плазмидной ДНК обычно больше 5000 bp. Компактизация ДНК такими катионными агентами, как липиды, полимеры или катионные полипептиды представляется разумным решением проблемы. Так, в результате компактизации плазмидная ДНК может образовывать псевдокристаллическую гексагональную [438,483] или тороидальную [591,592] структуры. При этом, молекула в 5500 bp может образовать сферу диаметром 34 нм что достаточно для похождения через ядерную пору [593].