3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

89

2.5.3. Виросомы и адъюванты

В иммунологии адъювантами называют агенты, не являющиеся антигенами, но способные усиливать иммунный ответ на вакцину. Кроме того, адъюванты способны ускорить иммунный ответ, а также увеличить продолжительность или увеличить антигенную специфичность иммунного ответа при их использовании в комбинации со специфическими антигенами вакцины. Среди адъювантов наиболее распространены соли алюминия (фосфат алюминия, гидрохлорид алюминия). Кроме того, в ветеринарии используются некоторые органические вещества, например, сквалены, принадлежащие к группе тритерпеновых углеводородов, а также некоторые масляные эмульсии на основе ланолина и его производных. Недавно адъювантная вакцина против гриппа, основанная на эмульсии масла в воде (содержащая сквален, детергент Tween 80 и триолеат сорбитана) была допущена к применению в медицине под названием FluAD. Клинические испытания проходит также адъювантная вакцина GlaxoSmithKline против гриппа. которая представляет собой эмульсию α- токоферола и сквалена [634].

Большие надежды возлагаются также на возможное усиление активности виросом с помощью адъювантов. Предполагается, что мембрана виросом может служить своеобразной платформой для прикрепления или внедрения адъювантов. Так, например, внедрение в мембрану виросом амфифильных адъювантов позволяет создавать агенты, способные одновременно активировать антиген-представляющие клетки и снабжать их антигеном. Действие адъювантов происходит через взаимодействие с Toll-подобными рецепторами, находящимися на поверхности лейкоцитов и ответственными за инициацию врожденного иммунитета. Например,

липопептидный адъювант N-palmitoyl-1-S-2,3(bispalmitoyloxy)-propyl- cysteinyl-seryl-(lysil)3-lysine может взаимодействовать с Toll-подобным рецептором 2-го типа лимфоцитов и дендритных клеток [694]. Единичная инъекция виросом с данным адъювантом может усилить иммунный ответ иммуноглобулинов IgG в 150 раз, как это было показано в экспериментах на животных [633]. Любопытно, что в качестве адъювантов, существенно усиливающих иммуногенность виросом, могут служить также липополисахариды патогенных микроорганизмов. Так, в экспериментах на мышах было обнаружено, что непатогенный аналог липополисахарида LpxL1 из оболочки патогенной бактерии Neisseria meningitidis (менингококк – возбудитель бактериального менингита и сепсиса), добавленный к виросомам гриппа, усиливал иммунный ответ в основном за счет повышения уровня иммуноглобулинов IgG2a [695].

90

2.5.4. Генетическая трансформация клеток с помощью виросом

Вирусы созданы природой для доставки генетического материала в клетки различных организмов. Поэтому представляется заманчивым использовать виросомы в медицине для доставки генетического материала в определенные клетки человека. Экспериментально показано, что с помощью виросом можно доставлять плазмидную ДНК [696], антисмысловые полинуклеотиды [697] или короткую интерференционную РНК (si-RNA) [639,698]. Для обеспечения условий, необходимых для ассоциации ДНК с виросомами, в состав виросом могут входить катионные липиды, например DODAC или DOTAP [640,647,697]. Исследования процессов доставки генетического материала были проведены на виросомах гриппа [641,696,699], вируса Сендай [614,616,700] или вируса везикулярного стоматита [618], которые использовались для трансфекции клеток различных тканей. Было показано, что присутствующие в виросомах белки слияния вносят существенный вклад в процесс трансфекции, поскольку способствуют проникновению ДНК в цитоплазму при увеличении кислотности среды в компартменте эндосом.

Плазмидная ДНК, при добавлении к готовым виросомам извне, адсорбируется на их поверхности и незащищена от действия протеолитических ферментов. Поэтому такие виросомы непригодны для введения в

русло крови, хотя демонстрируют повышенную эффективность трансфекции на клетках культуры тканей. Для внедрения ДНК во внутреннее пространство виросом была разработана новая процедура получения виросом с использованием дикапроил фосфатидилхолина, имеющего короткую углеводородную цепь в гидрофобной части, и обладающего свойствами детергента. В дальнейшем детергент удалялся посредством диализа

[696,699].

Представляется перспективным использование виросом для ДНКвакцинации [632,688,701]. Концепция ДНК вакцинации предполагает генетическую трансформацию клеток, в результате которой в теле хозяина продуцируются инородные белки, инициирующие иммунный ответ [702704]. Даже, так называемая, обнаженная плазмидная ДНК способна к трансфекции и инициации иммунного ответа. Однако клинические испытания показывают, что для достижения необходимого эффекта требуются слишком большие количества «обнаженной» ДНК. Различные методы повышения эффективности трансфекции, например, использование, так называемой, генетической пушки (gene gun), хотя приводит к существенному прогрессу в исследованиях на моделях [705-708], пока не вошло в клиническую практику и требует усовершенствования. Возможно, что использование виросом может способствовать дальнейшему прогрессу в данной области.

91

Глава 3

Адресация липидных наноконтейнеров

3.1. Поведение контейнеров в русле крови

Амфифильные нано- и микроконтейнеры с лекарственными веществами (липосомы, мицеллы, кубосомы и др.) при попадании в организм могут циркулировать в русле крови и накапливаться в различных органах и тканях. Интерес представляет возможность создания таких частиц, которые могли бы скапливаться рядом или непосредственно на поверхности тех клеток, на которые направлено воздействие данного лекарства. Эти клетки являются «мишенями» терапевтического воздействия, а меры для доставки контейнеров с лекарством преимущественно к клеткам-мишеням называется адресацией. Для обеспечения адресации необходимо знать фармакокинетику препарата. Различаются пассивная и активная адресация. При пассивной адресации условия доставки лекарства к мишеням во многом зависят от кинетических параметров движения частиц в организме. При активной адресации контейнеры снабжаются специальными устройствами, посредством которых можно управлять извне движением частиц и высвобождением лекарства, или же создаются контейнеры, которые способны самостоятельно находить цель и высвобождать лекарство в необходимом месте и в нужное время (пространственно-временная адресация).

Ожидается, что контролируемая в пространстве и времени доставка лекарственных веществ революционизирует процедуру лечения заболеваний. Адресное высвобождение потенциально токсичных лекарственных веществ непосредственно в область терапевтического воздействия может снижать побочные эффекты данного лекарства. Контроль высвобождения лекарств во времени позволит регулировать их содержание в организме в соответствие с особенностями течения заболевания или физиологическими потребностями организма, которые могут изменяться при различных видах деятельности, или с циркадными флуктуациями активности организма [709]. Для достижения этих целей устройство, доставляющее лекарство, должно циркулировать в русле крови достаточно длительное время, чтобы достичь и распознать соответствующие мишени.

92

3.1.1. Циркуляция частиц в крови

Длительной циркуляции частиц в русле крови препятствуют макрофаги ретикулоэндотелиальной системы (РЭС) способные удалять инородные тела в течение нескольких минут после из введения [710]. Наиболее эффективно частицы удаляются клетками Купфера (макрофагами печени) которые сами не способны идентифицировать частицы, но выявляют их по наличию специфических опсонинов (белков плазмы крови), прикрепленных к поверхности частиц [711]. Следовательно, опсонизация, т.е. адсорбция на поверхности частиц специфических белков плазмы – опсонинов, является главной причиной их быстрого удаления из русла крови. Опсонины – это компоненты крови, предназначенные для активации фагоцитарных процессов. Наиболее типичными примерами опсонинов являются иммуноглобулины и белки комплемента крови, такие как С3, С4, С5, а также некоторые друге белки крови, например, ламинин, фибронектин, коллаген первого типа [712-715]. После адсорбции на поверхности частиц и активации опсонины могут распознаваться фагоцитами, в отличие от свободных опсонинов, циркулирующих в русле крови. Фагоциты также способны взаимодействовать и эндоцитировать частицы, покрытые белками комплемента крови. Это связано с тем, что поверхность фагоцитарных клеток содержит специфические рецепторы, которые взаимодействуют с активированными опсонинами и белками комплемента крови, что инициирует процессы эндоцитоза.

Фагоциты «заглатывают» инородные частицы, после чего они обычно транспортируются в лизосомы, где подлежат деструкции ферментами пищеварительной системы фагоцитов. Однако многие синтетические полимерные материалы, входящие в состав наночастиц, не подлежат биодеградации. Молекулы, размером меньше 5000 кДа, или наночастицы диаметром не больше 5,5 нм могут удаляться через почки, но этот путь совершенно недоступен для больших молекул [716]. В результате, молекулы, которые не могут удаляться и не подлежат биодеградации, накапливаются в клетках РЭС печени, селезенки и других органов, что может вызывать различные негативные явления [717-723]. Необходима разработка методов, позволяющих увеличить время циркуляции частиц в крови, предотвратить их накопления в клетках РЭС и улучшить выведение из организма.

3.1.2. Липосомы-невидимки или стелс-липосомы

Опсонизация частиц является главной причиной их захвата клетками РЭС. Для предотвращения опсонизации были разработаны различные методы «маскировки» наночастиц. Специальные камуфляжные покрытия позволяют частицам незаметно обходить защиту РЭС и, благодаря этому,

93

существенно увеличить время циркуляции в крови [724]. Предполагается, что взаимодействие частиц с белками-опсонинами происходит в результате случайного столкновения между ними в процессе броуновского движения. В адсорбции белка на поверхности частиц участвуют силы Ван-дер- Ваальса, ионного, электростатического и гидрофобного взаимодействия [713]. Корреляция между величиной поверхностного заряда и процессом опсонизации проявляется в том, что менее заряженные частицы обычно меньше опсонизируются [725]. Поэтому химические группы, способные блокировать электростатические или гидрофобные взаимодействия, могут использоваться для увеличения времени циркуляции частиц в крови.

Наиболее эффективен и чаще всего используется полиэтиленгликоль (ПЭГ). Длинные цепи ПЭГ ковалентно прикрепляются к наночастицам. Целью покрытия частиц является создание стерических (пространственных) препятствий для адгезии опсонинов, присутствующих в крови. Поэтому такие частицы иногда называют стерически стабилизированными [726]. Кроме того, прикрепление ПЭГ к поверхности частиц придает им свойства «невидимости» для макрофагов ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), благодаря чему они могут существенно дольше циркулировать в русле крови [727]. Поэтому покрытые ПЭГ липосомы получили название «липосом-невидимок», или стелс-липосом (stealth liposomes). Среди полимеров, препятствующих опсонизации, кроме ПЭГ следует назвать поливинилпирролидон (ПВП), поли(ε-капролактон), поли(β- гидроксибутират), полимолочную кислоту, полистерол, сывороточный альбумин, желатин (В-тип), полисахариды, полиакриламиды, поливинилалкоголи и другие [713].

Частицы, покрытые водорастворимыми полимерами, могут циркулировать в течение многих часов. Наибольшее увеличение времени циркуляции в крови достигается при концентрации ПЭГ около 10 моль% [728]. Молекулярная масса цепей ПЭГ должна превышать 2000 Да. Возможно, что более короткие цепи не обладают необходимой гибкостью или не создают расталкивающий слой необходимой толщины. Время циркуляции частиц в крови прямо коррелирует с длиной цепей [729,730]. Полупериод выведения таких частиц может составлять многие часы и даже сутки в зависимости от размера частиц и используемого полимера [731-733].

Первым препаратом липосом, покрытым ПЭГ, который успешно прошел клинические испытания и был допущен применению в медицине в 1995 г., является препарат доксил (DOXIL® , производитель: Centocor Ortho Biotech Products, США; Schering-Plough Corporation, Израиль). Дан-

ный препарат содержит стелс липосомы (Stealth® , производитель: ALZA Corporation, США) с доксорубицином [734-736]. Этот препарат вышел на рынок многих стран, кроме США, под торговым названием Caelyx™ [737]. Показано, что входящие в состав этого препарата липосомы

94

(Рис.1), содержащие ПЭГ на поверхности, способны циркулировать более 50 часов в русле крови человека и накапливаться в сó лидных опухолях благодаря повышенной проницаемости сосудов опухолей данного типа. Указанные липосомы способны также очень медленно высвобождать доксорубицин (полупериод выхода t1/2 > 300 часов) поскольку этот препарат находится внутри липосом в преципитированном состоянии [738].

Рис.1. Строение липосом препарата DOXIL®, содержащих антиопухолевый препарат доксорубицин. Диаметр липосом приблизительно 100 нм. Они состоят из бислоя фосфатидилхолина сои и холестерина. На поверхности находится ПЭГ 2000 [737].

Использование стелс липосом позволило существенно снизить побочные эффекты, связанные с токсичностью доксорубицина, и повысить доставку лекарства в опухоли. Препараты, содержащие стелс липосомы с доксорубицином, успешно проходят клинические испытания в лечении опухоли молочной железы [739,740], саркомы Капоши [741], рака яичников [742] и других видов опухоли.

Существует несколько гипотез, объясняющих механизм действия водорастворимых полимеров, находящихся на поверхности частиц. Например, предполагается, что большое количество частиц просто перегружает систему опсонизации крови, что замедляет процесс удаления частиц и увеличивает продолжительность их циркуляции. Это создает ложное впечатление об их «невидимости» для РЭС [743]. Однако наиболее распространено предположение о том, что водорастворимые полимеры действительно способны препятствовать адсорбции белков на поверхности частиц [744]. Было установлено, что толщина слоя полимера, его молекулярный вес, состав и количество молекул на поверхности частиц имеют большое значение для циркуляции наноконтейнеров в крови [729,730,745-748].

Увеличения времени циркуляции частиц в крови можно достичь путем химической модификации полимеров, прикрепления дополнительных функциональных групп к линейным цепочкам, оптимизации физических параметров частиц, таких как размер и заряд, либо поиском новых полимеров, обеспечивающих более эффективную стерическую защиту частиц.

95

Так, значительного увеличения времени циркуляции можно было достичь сополимеризацией ПЭИ-ПЭГ [749]. Кроме того, прикрепление к ПЭГ липидного якоря в виде диацилглицеринов (ПЭГ-ДАГ) с жирными кислотами различной длины показало, что увеличение длины жирных кислот (наибольшая длина С18 для дистеароил глицерина) стабилизирует липосомы, увеличивает время циркуляции и увеличивает накопление в опухолевой ткани в 100 – 1000 раз [750]. Широко используются также конъюгаты ПЭГ с производными холестерина и фосфатидилэтаноламином (Рис.2). В случае прикрепления ПЭГ через эфирные связи (например: PEG-SA, PEG-CHEMS или PEG-CHMC) конъюгаты могут разрушаться под действием эстераз, присутствующих в сыворотке крови [751]. Однако, способность к биодеградации позволяет повысить эффективность доставки лекарственных веществ при эндоцитозе липосом клеткамимишенями.

Рис.2. Структура сополимеров ПЭГ с различными липидами:

PEG-SA – конъюгат ПЭГ и стеариновой кислоты PEG-DSG – конъюгат ПЭГ с дистероил глицерином PEG-DSPE – конъюгат ПЭГ с дистероил фосфатидилэтаноламином

PEG-CHEMS – конъюгат ПЭГ с холестерил хемисукцинатом PEG-CHMC – конъюгат ПЭГ с холестерил хлороформатом PEG-Chol – конъюгат ПЭГ с холестерином.

Прикрепление к линейным цепям ПЭГ дополнительных групп в форме ответвлений (branch-shaped) или в форме гребешка (comblike) создают лучшее стерическое препятствие для опсонинов и существенно (в 5 – 10 раз) увеличивают время циркуляции липосом в крови, по сравнению с обычным ПЭГ [752,753]. Недавно было обнаружено, что частицы, покры-

тые PHEA poly(hydroxyethyl-l-asparagine), могут также долго циркулиро-

вать в крови, как частицы, покрытые ПЭГ. Однако они обладают тем преимуществом, что PHEA биодеградирует [754]. Кроме того, частицы покрытые PHEA, обнаруживают значительные преимущества над

96

частицами, покрытыми ПЭГ, при повторных введениях в кровь или при малых дозах введенных частиц [754]. Не всегда понятна причинная связь между химическим строением полимера и временем циркуляции. Возможно, это связано с особенностями взаимодействия полимеров, находящихся на поверхности частиц, с опсонинами крови, что, в конечном счете, определяет распознавание частиц фагоцитами. Так, в сравнительном исследовании покрытий на основе ПВП и ПЭГ было показано, что частицы, покрытые ПВП, интенсивнее адсорбируют белки комплемента крови и иммуноглобулины, а ПЭГ покрытые частицы лучше адсорбируют аполипопротеины. Это различие объясняет более быстрое удаление клетками Купфера частиц покрытых ПВП по сравнению с частицами, покрытыми ПЭГ и, соответственно, большее время циркуляции в крови частиц с ПЭГ

[755].

3.1.3. Фармакокинетика наночастиц

Во многих экспериментах было показано, что в определенных условиях частицы способны самостоятельно накапливаться в областях развития патологического процесса. Примечательно, что области, в которых развиваются процессы воспаления или злокачественная трансформация тканей, способны «притягивать» частицы, если они не были удалены ранее макрофагами РЭС. Для частиц существует своеобразная альтернатива между клетками РЭС и тканями, вовлеченными в патологический процесс. Создание условий, препятствующих удалению частиц клетками РЭС, приводит к увеличению времени циркуляции и повышению их концентрации в крови, благодаря чему осуществляется пассивная адресация частиц в области патологических процессов.

Было обнаружено, что диаметр частиц существенно влияет на скорость их удаления клетками РЭС и, следовательно, на время их циркуляции в русле крови [756-760]. Кроме того, было показано, что чем дольше частицы циркулируют в русле крови, тем больше их скапливается в сó лидных опухолях [761-763]. Возможно, что за время циркуляции больше частиц может достичь опухоли. В действительности, соотношение между размером частиц и их способностью накапливаться в опухолях не простое. Детальный анализ зависимости накопления частиц в опухоли от диаметра показал, что может существовать некий оптимальный размер частиц, накапливающихся в опухолях. Частицы диаметром около 100 - 150 нм накапливались в опухоли в больших количествах, чем частицы большего или меньшего размера [761]. В другом исследовании зависимости времени циркуляции от размеров частиц [731], покрытых ПЭГ, было показано, что частицы диаметром 160 – 220 нм циркулировали наиболее продолжительное время, меньше накапливались в печени и селезенке

(Рис.3).

97

Рис.3. Циркуляция липосом различного диаметра в крови кролика [731]. Липосомы из фосфатидилхолина, холестерина, ПЭГ-фосфатидилэтаноламина и α-токоферола (молярное соотношение 90:80:4,5:3,9). Количество липосом определяли по радиоактивной метке.

Одно из наиболее распространенных объяснений этого явления заключается в том, что в здоровых тканях размер пор между клетками эндотелия, выстилающего стенки капилляров, достаточно мал, что создает препятствия для выхода частиц из кровотока и проникновения в ткани. Напротив, в области патологических процессов капилляры нарушены, что проявляется в увеличении проницаемости эндотелия для наночастиц. Выходу частиц из капилляров способствует также увеличенный поток лимфы в ткани (Рис.4).

Захват наночастиц патологическими тканями называется эффектом «повышенной проницаемости и удержания» (ППУ) [764-766]. Благодаря ППУ стерически стабилизированные липосомы способны накапливаться в опухолях, областях воспалительных процессов и локальной инфекции (абсцесс). Так, в эксперименте с липосомами диаметром от 90 до 220 нм было показано, что самые малые липосомы (90 нм) лучше всего накапливались в области абсцесса [767]. Было также показано, что покрытые ПЭГ мицеллы или липосомы могут накапливаться в сердечной ткани, поврежденной после экспериментального инфаркта [764]. В пораженных зонах концентрация покрытых ПЭГ наночастиц может во много раз превышать концентрацию в окружающих тканях, что можно использовать для защиты миокарда с помощью липосом, нагруженных АТФ или коэнзимом Q [768-771] и обеспечивать направленную трансфекцию пораженных тканей липоплексами с плазмидной ДНК [772], что создает благо-

98

приятные перспективы для генетической терапии пораженных областей. Большое количество исследований эффекта ППУ демонстрирует также преимущественное накопление наночастиц в опухолевых тканях, что создает благоприятные условия для направленной доставки веществ в эти области [761-763,773,774].

Рис.4. Влияние стерической стабилизации наночастиц на их фармакокинетику. Обнаженные частицы (1) быстро покрываются белками опсонинами крови и при движении через капилляры печени удаляются клетками Купфера посредством эндоцитоза. В клетках Купфера частицы доставляются в лизосомы, где происходит их разрушение. Стерически стабилизированные частицы (2) не взаимодействуют с опсонинами, не распознаются клетками эндотелиальной системы и, благодаря этому, могут долго циркулировать в крови, достигать патологически измененных областей (опухоли, абсцесс). Эндотелий пораженных тканей имеет просветы и обладает повышенной проницаемостью для наночастиц, которые, благодаря этому, способны проникать в эти ткани и накапливаться (удерживаться) в них.

Проявление эффекта зависит от структуры опухолевой ткани при различных формах заболевания. Опухоли с более развитой васкуляризацией и более рыхло лежащими клетками эндотелия, т.е. имеющими большие межклеточные просветы, могут аккумулировать частицы большего диаметра, чем опухоли с плотным эпителием, где размер просветов между клетками недостаточен для проникновения больших частиц [737]. Вариабельность в структуре контейнеров, такие, как различия в размерах (обычно 10 нм до нескольких мкм), или количество слоев мембран в липосомах, поверхностный заряд (анионные или катионные частицы), могут существенно влиять на процесс выхода лекарств из контейнеров.