3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

59

2.3.1. Структура и состав липидных наночастиц

Твердые липидные наночастицы (ТЛН) имеют гидрофобное ядро, состоящее из липидов с температурой плавления выше температуры тела. Для стабилизации в водной среде их поверхность покрыта сурфактантами. В состав большинства частиц входят моно-, ди- и триглицериды, содержащие насыщенные жирные кислоты с повышенной температурой плавления: лауриновая, миристиновая, стеариновая, пальмитиновая, бегеновая (Табл.2). В состав сурфактанта могут входить как синтетические, так и природные липиды, обычно находящиеся в жидком состоянии при физиологических температурах.

Таблица 2. Состав некоторых твердых липидных наночастиц

Недостатком классических твердых наночастиц является низкая емкость для лекарственных веществ. Кроме того, эти вещества могут выходить в окружающий раствор, что ограничивает время хранения суспензий. Значительное увеличение стабильности наночастиц было достигнуто при введении в состав гидрофобного ядра некоторого количества (до 30%) жидких липидов, т.е. липидов, находящихся в расплавленном состоянии при комнатной температуре. Для этих целей обычно используют глицериды (Рис.10), содержащие короткоцепочечные или ненасыщенные жирные кислоты: смесь каприловой и каприновой кислот [350-352], свободную олеиновую кислоту [353,354] или жидкие природные смеси, например, сквален [355].

60

Рис. 10. Наиболее часто используемые компоненты ТЛН и НЛП. Моно-, ди- и триглицериды. Представлены монопальмитат глицерина (а), дипальмитат глицерина (б), трипальмитат глицерина (в). Триблоксополимер полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, входящий в состав полоксамеров и плуроников. Полимеры этой группы отличаются количеством блоков x, y, z – (г), жирные кислоты: каприновая – (д), каприловая – (е), пальмитиновая – (ж), стеариновая – (з), олеиновая – (и).

Предполагается, что твердые липиды, например, трипальмитат или тристеарат глицерина образуют высокоупорядоченные кристаллические структуры в которых остается мало места для лекарственных веществ (Рис.11 а). Емкость для лекарств может также снижаться в процессе хранения частиц в связи с ростом кристаллов и вытеснением лекарств на периферию гидрофобного ядра, где молекулы лекарства могут высвобождаться в окружающий раствор (Рис.11 б). Присутствие жидких липидов в составе гидрофобного ядра препятствует росту кристаллов твердых липидов. Жидкие липиды могут стабилизировать пространства между кристаллами, где располагаться лекарственные вещества. Возможно, что жидкие липиды способны образовывать в ядре мицеллярные наноструктуры, в которых могут содержаться лекарства (Рис.11 в). В этом случае эмульсия может быть сходна с широко известными эмульсиями типа вода/масло/вода [356,357]. Такое ядро можно назвать «комплексным» (multiple type), а частицы получили название: «наноструктурированные липидные переносчики» (НСП).

61

Рис.11. Твердые липидные наночастицы (ТЛН) содержат кристаллическое гидрофобное ядро, окруженное оболочкой из сурфактанта. В пространствах между кристаллами находится лекарственное вещество – черные треугольники (а). В процессе хранения происходит укрупнение кристаллов, что приводит к вытеснению молекул лекарства в окружающую среду (б). При добавлении жидких липидов, в ядре образуются наноструктуры, возможно, мицеллы, где могут храниться молекулы лекарства. Такие частицы называются наноструктурированными липидными переносчиками - НЛП (в). Конъюгаты лекарства и липида (КЛЛ) позволяют удерживать гидрофильные молекулы лекарства в ядре и препятствуют росту кристаллов (г).

Для хранения водорастворимых веществ в гидрофобном ядре частиц были разработаны конъюгаты лекарства с липидом (КЛЛ), что позволяет многократно повысить эффективность загрузки (Рис.11 г). Такие конъюгаты могут быть созданы с использованием электростатического взаимодействия, например, образования комплекса между положительным зарядом молекулы лекарственного вещества с жирной кислотой, либо за счет ковалентного связывания лекарства с липидом, например, образования эфиров [246,329,332,333,356,357]. Так, лекарственное вещество диминазен в комплексе с жирными кислотами предлагается использовать при лечении трипаносомоза, распространенного в некоторых африканских странах [358,359]. Этот подход предлагается использовать также при лечении других паразитарных инфекций включая малярию и лейшманиоз [360]. С помощью липидных наночастиц можно также доставлять на поверхность кожи конъюгат аскорбиновой и пальмитиновой кислот, аскорбил пальмитат, который защищает клетки от перекисного окисления и может использоваться в косметике [361,362].

Электронная микроскопия ТЛН и НЛП свидетельствует о большом разнообразии структурной организации частиц имеющих различный состав и получаемых различными методами (Рис.12). Частицы могут также существенно различаться по размерам. Их гидрофобное ядро обычно не обнаруживает структурированности, хотя в некоторых случаях можно наблюдать присутствие кристаллических структур.

63

В некоторых препаратах кроме частиц, имеющих форму, близкую к сферической, можно также видеть частицы вытянутой формы, и даже сильно удлиненные палочковидные кристаллы (Рис.12 г). Следует отметить, что в настоящее время недостаточно ультраструктурных исследований различных видов частиц.

2.3.2. ТЛН, НЛП и КЛЛ в доставке веществ

Твердые липидные наночастицы могут найти разнообразное применение для доставки лекарств перорально, парентерально, трансдермально и другими путями. При пероральном введении могут быть использованы таблетки, капсулы, сиропы. Можно предположить, что суспензии частиц будут добавляться в пищевые продукты. Однако в настоящее время такие препараты не созданы. Возможности парентерального введения через вены исследовались на животных. При этом было обнаружено, что частицы могут доставлять лекарственные вещества в легкие, селезенку, печень, почки [329]. Они способны преодолевать гематоэнцефалический барьер и доставлять вещества в мозг [367,368].

Для введения лекарственных веществ в организм большие возможности открываются также при трансдермальном использовании липидных наночастиц. С помощью ТЛН и НЛП можно наносить на поверхность кожи такие лекарственные агенты, как имидазольные антифунгальные лекарства, например, кетоконазол [369,370], флурбипрофен, снимающий воспалительные процессы при артритах [328,371], глюкокортикоиды [372374], антиканцерогенные препараты [375], витамин А [376], лекарство против угрей изотретиноин [377]. Их можно использовать также для трансдермальной ДНК вакцинации [378]. При нанесении на поверхность кожи применение водных суспензий наночастиц нежелательно в связи с их низкой вязкостью и низкой концентрацией. Однако наночастицы могут быть заключены в полимерные гели, среди которых наибольший интерес представляют такие природные полимеры, как хитозан, декстран, целлюлоза, ксантановая камедь. Могут также использоваться синтетические полимерные гели, включая полиакрилаты, полоксамеры, карбополы [331]. Исследовалась также возможность использования готовых гелей, выпускаемых фармацевтической промышленностью, например, выпускаемые BASF (Германия) гели Tristan® или Neutrol®, для доставки лекарственного вещества валдекоксиб (Valdecoxib), применяемого при лечении артритов [379], или доставка жирорастворимых витаминов [376]. Использование липидных наночастиц, заключенных в гели, улучшает гидратацию различных слоев кожи, что способствует проникновению лекарственных препаратов. Отличительной особенностью липидных наночастиц является

64

безопасность и хорошая переносимость при использовании на поверхности кожи, что позволяет их называть «нанобезопасными» средствами доставки лекарств [335].

Исследуется также возможность использования липидных наночастиц в офтальмологии [340,380]. Например, возможность доставки иммунодепрессанта циклоспорина, который можно применять в трансплантологии [339,381], препарата против глаукомы тимолола [382], антибиотика гатифлоксацина [383] и тобрамицина [384], антифунгальных агентов [341]. Суспензии ТЛН, содержащих лекарственные вещества, удобны для ингаляции легких [337]. При этом, сами частицы характеризуются низкой токсичностью [338]. ТЛН можно использовать для доставки инсулина через легкие, что можно рассматривать в качестве неинвазивного способа доставки этого гормона [385]. С помощью ТЛН можно также доставлять глюкокортикоидные гормоны, например дексаметазон [386].

Большое число работ посвящено исследованию доставки агентов в терапии злокачественных опухолей с использованием ТЛН. Показано, что наночастицы, нагруженные доксорубицином или идарубицином, способны успешно преодолевать клеточный барьер устойчивости к лекарственным препаратам [76,387]. В состав частиц могут входить и другие токсические вещества, которые можно доставлять в цитоплазму клеток опухолей. К ним относятся подофиллотоксин [388], азотистый иприт [389], докатаксель [390] и другие. Для адресной доставки частиц к клеткам опухоли к поверхности частиц можно прикреплять полимеры (полиоксиэтилен) с химически активными, так называемыми, «функциональными группами», которые можно использовать для прикрепления различных маркеров и рецепторов. Например, прикрепить пептид cRGD, который позволяет адресно доставлять частицы к маркеру ангиогенеза капилляров опухолей, к альфа(v)-бета(3)-интегрину [391]. Прикрепление к поверхности частиц компонентов липопротеинов высокой плотности позволяет существенно увеличить время присутствия частиц в крови и повышает их адресацию к тканям опухолей [392]. ТЛН можно также направлять к рецепторам фолиевой кислоты на поверхности клеток опухолей, если молекулы фолиевой кислоты прикреплены к их поверхности [393]. Недавно появилась серия исследований конъюгатов лекарства с липидам (КЛЛ). Так, конъюгат 10-гидроксикамптотецина с фосфатидилхолином использовался для создания липидных наночастиц, которые предполагается применять в лечении гепатомы [394]. Конъюгат симвастатин-токотриенол- липид предполагается использовать для обработки злокачественных клеток эпителия [395].

ТЛН можно использоваться также в генной терапии для доставки ДНК в клетки. Было показано, что проникновению частиц в цитоплазму

65

могут способствовать ТАТ-пептиды, прикрепленные к поверхности частиц. Для увеличения времени циркуляции в крови частицы были покрыты ПЭГ [396]. Было показано, что использование катионных липидов при создании СЛН позволяет эффективно адсорбировать на их поверхности ДНК и другие вещества [397]. Комплексы катионных липидных наночастиц с ДНК получили название геносферы [396,398,399].

2.4. ДНК/липидные комплексы – липоплексы

Идея лечения заболеваний на уровне генома бала предложена около 40 лет назад [400], однако лишь в последние два десятилетия она стала предметом интенсивных научных исследований и первых, не всегда успешных, попыток применения в медицинской практике. Хотя большинство исследований в этой области посвящено использованию вирусов для доставки генетического материала к клеткам различных органов, использование липосом рассматривается как привлекательная альтернатива вирусной трансфекции поскольку существенно снижает риск развития нежелательных иммунных реакций и возникновения мутаций. Так, было обнаружено, что вирусные векторы могут инициировать мутагенез и вызывать канцерогенную трансформацию клеток [401-405], что привело к трагическим событиям в процессе клинических испытаний [406] и стало причиной резкого сокращения клинических исследований в данной области в последние несколько лет.

Более 20-ти лет назад было предложено использовать катионные липиды для доставки генетического материала в клетки, в связи с чем был предложен термин «липофекция» [407,408]. С тех пор применение липосомальных векторов постоянно возрастает и, несмотря на то, что вирусные векторы продолжают сохранять несомненное лидерство в биомедицине [409-411], в 2009 году проводилось 93 клинических испытания с использованием липоплексов, что составляет 5,7% от общего числа испытаний в этой области (см. http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical/).

Конструкции липосомальных контейнеров созданных в последние годы позволяют им длительно циркулировать в русле крови и взаимодействовать с клетками различных органов и тканей [215,412,413]. Однако число доставляемых копий гена и уровень экспрессии генов все еще остается ниже, чем необходимо для достижения терапевтического эффекта. Для объяснения наблюдаемых трудностей в трансфекции была разработана концепция клеточных барьеров для проникновения ДНК. Наличие таких барьеров было обнаружено еще в ранних исследованиях процессов трансфекции вирусами [414,415], а затем липоплексами [407]. Было обнаружено [412,416-422], что плазматическая мембрана является первым

66

барьером для проникновения липоплекса в цитоплазму. Препятствия возникают также при перемещении липоплексов в перинуклеарную область, при высвобождении ДНК из липидного окружения и при проникновении в ядро. Доставке ДНК мешает присутствие литических ферментов и высокая вязкость цитоплазмы связанная с эффектом «молекулярного скучивания».

2.4.1. Липидный состав липоплексов

Прогресс в использовании липидов для доставки генетического материала связан с достижениями в синтезе катионных липидов. Первый катионный липид DOTMA (Рис. 13) был впервые предложен в конце 1980-х годов [407,408] и до сих пор используется во многих исследованиях. Смесь DOTMA с нейтральным липидом DOPE позволила существенно увеличить эффективность трансфекции и была использована при создании первого коммерческого препарата Lipofectin® (GIBCO, США) применение которого в настоящее время ограничено в связи с его токсичностью [423]. Использование молекул, химически сходных с природными липидами и способными к биодеградации позволяет существенно снизить токсичность липоплексов. Поэтому широкое применение нашли такие производные диацилглицерина, как DOTAP и DODAP. Низкой токсичностью обладают также DDAB [424-426] и CTAB [427-429], что позволяет использовать их при создании различных наночастиц. Существенный прогресс в снижении токсичности катионных липидов был достигнут путем придания катионного заряда таким природным липидам, как фосфатидилхолин и холестерин. В результате были получены такие эффективные переносчики полинуклеотидов, как EDOPC – катионный фосфолипид [430,431] и катионные производные холестерина, среди которых наиболее известны DC-холестерин и CTAP [432-434]. Исследовались также и другие стероидные катионные липиды, включая производные витамина D [435], желчные кислоты [436] и стероидный антибиотик [437].

Увеличение числа положительных зарядов в молекуле липида иногда приводит к повышению трансфекционной активности. Поэтому широкое распространение получили липиды, к которым прикреплены молекулы полиаминов, несущие несколько положительных зарядов. Примером таких липидов служат DOGS, DOSPER, DOSPA. Липидный дендример MVLBG2 несет до 16 положительных зарядов [438].

67

Рис.13. Липиды, используемые для трансфекции клеток и генной терапии. DOPE – 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine; DOTMA – N-(1-(2,3-dioleyloxy) propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride; DOTAP – N-(1-(2,3-dioleoyloxy)propyl)- N,N,N-trimethyl-ammonium chloride; DODAP – dioleoyldimethylaminoxy propane; EDOPC

– ethyldioleoylphosphatidylcholine; DC-Chol – DC-cholesterol, или 3β-[N-(N',N'-dimethyl aminoethyl)carbomoyl]cholesterol; CTAP – N15-cholesteryloxycarbonyl-3,7,12-tri- azapentadecane-1,15-diamine; CTAB – cetyltrimethylammonium bromide; DDAB – dioctadecyldimethylammonium bromide; DOGS – dioctadecylamidoglycylspermine или transfectam; DOSPER – 1,3-dioleoyloxy-2-(6-spermylcarbonylamino)propane; DOSPA – N-[1- (2,3-dioleyloxy)propyl]-N-[2-(6-spermylcarbonylamino)-ethyl]-N,N-dimethylammonium [438,439].

68

Важнейшей задачей является создание катионных липидов, способных осуществлять эффективную трансфекцию клеток как в условиях клеточной культуры, так и на целом организме. В последние годы было исследовано большое разнообразие возможных вариантов модификации молекул с целью выявить наиболее эффективные комбинации гидрофильных и гидрофобных частей молекул, а также связующих участков (линкеров) между ними [440]. Например, сравнивались молекулы, имеющие от одного до четырех гидрофобных углеводородных цепей.

Одноцепочечеые катионные липиды часто были мало эффективны в трансфекции и проявляли повышенную токсичность [441,442]. Это правило имеет исключения и некоторые одноцепочечные катионные липиды способны проявлять высокую активность. Так, было показано [443], что одноцепочечный катионный липид OLON был более активен, чем его двухцепочечный аналог. Другой пример одноцепочечного липида, проявляющего достаточно высокую активность в трансфекции является RPR 228091 [444].Трехцепочечные катионные липиды также часто бывают менее активны, чем двухцепочечные [441]. Однако, если третья цепочка существенно короче остальных или может легко удаляться внутриклеточными ферментами, активность липида может быть существенно повышена [445-447]. Так, катионный липид RPR 132688, содержащий третью углеводородную цепь С5, прикрепленную через дисульфидный мостик, способный легко отделяться при действии ферментов цитоплазмы, проявлял повышенную активность в трансфекции [445,447]. Активность снижалась при увеличении длины цепи до С12.

Были синтезированы также липиды, содержащие четыре углеводородные цепи, благодаря чему их можно рассматривать как аналоги кардиолипина [448-450]. Катионный липид TODMAC6, образованный из двух молекул DODAC, соединенных перемычкой из пяти атомов углерода, проявлял активность, близкую к DODAC, однако активность снижалась при уменьшении длины перемычки.

В целом, можно прийти к выводу, что две углеводородные цепи в молекуле катионных липидов следует считать оптимальным для трансфекции. Липиды с иным числом цепей могут проявлять токсичность, препятствовать образованию липидного бислоя и проявляют пониженную активность в трансфекции [440].

Исследовалось также влияние ненасыщенности углеводородных цепей. Было обнаружено, что существенным является количество и положение двойных связей в цепи, а также цис-транс изомерия. Лишь в немногих исследованиях было показано преимущество транс-изомеров по сравнению с цис-изомерами [451]. Противоположные данные о преимуществах цис-изомеров были получены на исследованиях симметричных катионных триглицеридах [452]. Кроме того, в большом числе исследований