3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

39

1.2.5. Небислойные липиды в функционировании белков

Различают интегральные и периферические мембранные белки. Периферические белки прикреплены к поверхности клеточных мембран благодаря электростатическим взаимодействиям. Они могут удаляться с поверхности мембраны при изменении концентрации солей, температуры или величины рН. Интегральные мембранные белки имеют гидрофобные сайты, способные погружаться вглубь бислоя, или даже пронизывать бислой насквозь. Их взаимодействие с мембранной на много прочнее. Для получения интегральных белков в очищенном виде требуется разрушение липидного бислоя, которое, обычно, производится с помощью детергентов.

Проникая вглубь бислоя, интегральные белки оказывают значительное влияние на организацию липидов, благодаря чему в ближайшем окружении белков создается оболочка из слоя липидов с измененными физическими свойствами. Эти липиды называют аннулярными [124,185188]. Кроме того, интегральные белки способны избирательно взаимодействовать с некоторыми липидами. Оценка изменения свободной энергии Гиббса (∆G) при взаимодействии различных интегральных белков с фосфолипидами, полученная с использованием спин-меченых липидов [124], показывает, что в большинстве случаев белки имеют предпочтение к цвиттерионному липиду РС по сравнению отрицательно заряженными липидами CL, PA, SA, PS, PG. Кроме того, некоторые белки, например протеолипид миелина, Са2+-АТФаза саркоплазматического ретикулума, белки грамотрицательных бактерий OmpA, FhuA, KcsA обнаруживают предпочтительное взаимодействие с РЕ – липидом, молекулы которого при физиологических условиях имеют коническую форму и образуют гексагональную HII фазу. Необходимость присутствия РЕ проявляется также у зрительного родопсина [189]. Даже некоторые периферические мембранные белки, например G-белок, проводящий сигнал от мембранных рецепторов к различным регуляторным белкам в цитоплазме, требует присутствия РЕ для взаимодействия с бислоем [190]. РЕ необходим также для осуществления широкой совокупности событий переноса сигнала от рецептора к G-белкам, функционирования адренергических рецепторов и аденилил циклазы [191]. Зависимость от присутствия РЕ и способности мембран к полиморфным фазовым переходам обнаруживает белок апоптоза t-Bid, который увеличивает отрицательную кривизну слоя липидов [192], или белок Bax, который увеличивает положительную кривизну слоя липидов [193]. В обоих случаях наблюдается дестабилизация бислоя, что способствует увеличению проницаемости мембран в процессе апоптоза.

40

Было проведено обширное исследование [60,194] роли внутренней кривизны слоя липидов и способности липидов образовывать инвертированные кубические или гексагональные фазы в функционировании таких белков как протеинкиназа C (РКС – protein kinase C) и фосфохолин цити-

дилилтрансфераза (СТ – phosphocholine cytidylyltransferase). Известно, что РКС влияет на функции других белков путем фосфорилирования гидроксильных групп остатков серина и треонина. На активность этого белка оказывает влияние липид диацилглицерин, способный инициировать формирование инвертированных фаз, таких как гексагональная НII фаза, и являющийся вторичным мессенджером [195-198]. Другой белок – СТ участвует в процессах фосфорилирования липидов и образования цитидилдифосфата холина [199,200].

Наиболее детальные исследования влияния липидного состава на структурную организацию белков были проведены на бактериальных клетках. На примере пермиазы лактозы (LacY), имеющий 12 α- спиральных трансмембранных сегментов, было показано влияние липидного состава на ориентацию сегментов в процессе их синтеза и внедрения в бислой [201]. Так, в отсутствии PE сегменты LacY ориентируются неправильно, что приводит к появлению неактивной формы белка. Поскольку молекула РЕ имеет коническую форму, можно предположить, что этот фактор является существенным при сборке белковой молекулы. Как показано на схеме (Рис.17 А), нативная конформация белка лучше адаптирована к присутствию липидов с отрицательно кривизной (обозначено, как N-конформация). В бислое, где доминируют липиды цилиндрической формы, происходит изменение ориентации трансмембранных сегментов (U-конформация). При этом, молекуле приходится «жертвовать» одним из трансмембранных сегментов, оставляя его на поверхности бислоя. Участие липидов, в поддержании нативной конформации белков в процессе их синтеза (липидные шапероны - chaperons) было впервые продемонстрировано Богдановым на бактериальных клетках [202], а позже обнаружено в клетках эукариот, включая млекопитающих [203-205].

Присутствие липидов, способствующих образованию инвертированных структур, важно также при формировании трансмембранных каналов, инициируемых бактериальным токсином аэролизином [197]. Было обнаружено, что различные агенты, инициирующие формирование инвертированных фаз в липосомах из фосфатидилхолина, например PE, ДАГ, холестерин или гексадекан, способствовали формированию трансмембранного канала. При этом, была обнаружена не только концентрационная зависимость проницаемости канала от присутствия этих агентов, но также наличие аддитивного эффекта при их совместном действии. Напротив, агенты, уменьшающие отрицательную кривизну, например лизофосфатидилхолин, препятствовали образованию каналов аэролизина. Гипотетическая

41

иллюстрация указанных процессов представлена на схеме (Рис.17 Б). Предполагается, что изменение проницаемости канала может коррелировать с изменениями конформации молекулы белка, как это показано на схеме. Присутствие липидов различной формы может стабилизировать одну их двух возможных конформаций белка и приводить к изменениям проницаемости канала [206].

Рис.17. Влияние липидов и мембранотропных агентов на структуру белков и белковых комплексов. Присутствие молекул различной формы (конус или перевернутый конус) также может влиять на ориентацию трансмембранных сегментов гидрофобных белков (А) или поддержание трансмембранных каналов в открытом или закрытом состоянии (Б).

Нарушения конформации интегральных мембранных белков широко распространено также в эукариотичеких клетках и является причиной разнообразных заболеваний, которые относят к категории конформационных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, губчатый энцефалит домашних животных, прионные заболевания, катаракта, цистический фиброз [123]. Хотя во многих случаях причиной этих заболеваний является нарушение конформации водорастворимых белков, мембранные липиды могут оказывать влияние на конформацию этих белков в процессе сворачивания полипептидной цепи, как это было показано для прионного белка PrP [207], для главного компонента амилоидных бляшек Альцгеймера, пептида βАР [208,209], для белка CFTR, точечная мутация которого является причиной цистического фиброза [210].

42

Глава 2

Липидные наноконтейнеры

2.1. Липосомы и другие липидные частицы

Липосомы представляют собой замкнутые пузырьки, образованные одним или несколькими бислоями липидов, в нутрии которых заключено пространство, обычно заполненное водой, с растворенными в ней веществами. Липосомы впервые были получены и исследовались под электронным микроскопом методом негативного окрашивания около полувека назад [211,212]. В настоящее время разработаны методы получения различных липосом, которые можно разделить на несколько видов, основываясь на их размере и характере ламеллярности (Рис.1). Обычно различают ма-

лые моноламеллярные везикулы (SUV – small unilamellar vesicles), имею-

щие один бислой липидов сферической формы диаметром 10 – 100 нм,

большие моноламеллярные везикулы (LUV – large unilamellar vesicles),

диаметр которых находится в переделах 100 – 1000 нм, гигантские моно-

ламеллярные везикулы (GUV – gigantic unilamellar vesicles) с диаметром более 1мкм. Кроме того, различают мультиламеллярные везикулы (MLV – multilamellar vesicles), которые образованы множеством концентрически расположенных сферических бислоев, напоминающих по форме луковицу. Наконец, различают олиговезикулярные везикулы (OVV – ologovesicular vesicles), в которых малые везикулы располагаются внутри большой везикулы [43,213].

Липосомы субмикронных размеров или наноразмеров получают обычно путем фрагментации более крупных мультиламеллярных липосом, образующихся спонтанно при гидратации фосфатидилхолинов или фосфатидилхолин содержащих смесей природных липидов, называемых лецитинами. Мультиламеллярные липосомы фрагментируют ультразвуковой обработкой или путем продавливания через фильтры с калиброванными отверстиями. В последнем случае можно получать липосомы строго заданного размера. LUV липосомы образованы бислойными структурами фосфолипидов, непроницаемыми для водорастворимых веществ, что позволяет использовать их в биомедицине и фармокологии в качестве контейнеров для хранения и доставки лекарств в организм [214-216].

43

А

Б

Рис.1. А - Схематическое изображение различных видов липосом: моноламеллярных (а), мультиламеллярных (б) и олиговезикулярных (в). Б – Электронномикроскопические фотографии больших мультиламеллярных везикул (MLV) . Изображение поучено методом замораживания-скалывания (а). Большие моноламеллярные везикулы (LUV) диаметром около 100 нм, полученные путем продавливания MLV через фильтр с диаметром отверстий 100нм. Изображение получено с использованием крио-трансмиссионной электронной микроскопии (б).

Следует отметить, что липосомы достаточно пластичны и не всегда имеют сферическую форму (Рис.2). В некоторых случаях форма везикул может быть описана такими терминами, как «теннисные ракетки», «бумеранги», «морские звезды» [217,218]. Возникновение таких структур определяется вязко-эластическими свойствами бислоя. Кроме того, под действием осмотических сил форма везикул может также изменяться, что может приводить к возникновению стоматоцитов, дискоцитов, продолговатых структур – пролатов (prolates), грушевидных структур

[219].

45

образом, чтобы мицеллы образовывали устойчивые коллоиды, способные сохранять стабильность и не агрегировать в течение длительного времени. Образование мицелл происходит при достижении определенной концентрации амфифилов, которую называют критической концентрацией мицеллообразования (ККМ), ниже которой молекулы растворены в мономолекулярной форме. Кроме того, для образования мицелл температура среды также должна превышать некоторое значение, которое называется критической температурой мицеллообразования (КТМ).

Как переносчики лекарственных веществ, мицеллы обладают рядом достоинств [220-222], к которым относятся способность растворять лекарства, плохо растворимые в воде, или обладающие токсичностью. Кроме того, благодаря малым размерам, мицеллы обладают повышенной способностью проникать через физиологические барьеры, что может благоприятно сказываться на биораспределении мицелл в организме. Мицеллы на основе желчных кислот и лецитина используются с начала 1980-х годов для парентеральной доставки лекарственных веществ, например, диазепама [223] и создания систем внутривенной доставки различных терапевтических средств, включая витамины [224]. Но такие мицеллы имеют некоторые ограничения, связанные с малым объемом гидрофобной части. Поэтому в мицеллы часто добавляют сурфактанты, этанол или смеси растворителей, чтобы увеличить их внутренний объем или достичь более высокой концентрации лекарства внутри мицелл. Так были получены концентрированные суспензии мицелл, содержащих антиканцерогенный агент паклитаксель, что способствовало решению проблемы плохой растворимости этого лекарства в воде [225].

В качестве альтернативы системам, образованным на основе липидных сурфактантов, были созданы также мицеллы на основе блоксополимеров [221]. Полимеры содержат гидрофобные блоки, такие как поликапролактон, и гидрофильные блоки, содержащие полярные, иногда заряженные молекулы, такие как полиаспарагиновая кислота, полимолочная кислота, а также снабжены сегментом из ПЭГ. Такие мицеллы характеризуются большей стабильностью in vivo, способны к биодеградации, низкотоксичны и обладают большим объемом для лекарств. Ряд полимерных мицелл сейчас находится на стадии клинических испытаний

[222,226,227].

Липиды также способны образовывать бислойные трубчатые структуры наноразмеров – нанотрубки (Рис.3 б). Простое вытягивание иммобилизованных гигантских везикул с помощью микропипетки может приводить к образованию трубок [228,229]. Поток жидкости в микроканалах также может приводить к образованию мембранных микро- и нанотрубок из фосфатидилхолина длиной в несколько сантиметров [230]. Разработаны методы создания множества параллельно ориентированных липидных

46

трубок [231]. Трубки из фосфатидилхолина можно «сворачивать» с использованием сил взаимодействия стрептавидина с бислоем, на поверхности которого находятся молекулы биотина [232]. Трубки и диски образует смесь фосфатидилхолина, сфингомиелина и холестерина [233]. Синтетические гликолипиды способны спонтанно образовывать нанотрубки, с внутренним диаметром около 10-15 нм и длиной до 100 мкм [234]. Спонтанно могут образовываться нанотрубки из синтетического полимеризуемого производного фосфатидилхолина [235]. Липидные нанотрубки могут найти различное применение не только для хранения лекарств, но и для синтеза линейных полимеров или для ориентации больших линейных молекул, например ДНК [236].

Некоторое внешнее сходство с липидными трубками имеют кохлеаты

– свернутые в спираль (рулон) бислойные структуры (Рис. 3 в). Кохлеаты (от английского cochlea – улитка) могут быть образованы, например, бислоем, содержащим фосфатидилсерин в присутствии ионов кальция [237]. Молекулы, несущие положительный заряд, включая лекарственные вещества, могут формировать мостики между бислоями, содержащими отрицательно заряженные липиды. Благодаря силам взаимодействия между поверхностями бислоя мембрана сворачивается в рулон. Разворачивание такого рулона, происходящее при изменении кислотности среды, приводит к высвобождению вещества, что можно использовать для доставки лекарств в некоторые органы [238]. Кохлеаты, возможно, найдут применение для перорального введения лекарств, например, амфотерицина В [239,240], и ряда других лекарственных веществ [241], однако их нельзя вводить в русло крови поскольку наночастицы, содержащие фосфатидилсерин, быстро удаляются клетками ретикулоэндотелиальной системы.

Способность некоторых липидов образовывать кубическую и гексагональную фазы находит применение при создании кубосом и гексосом (Рис.3 г, д). Суспензии таких частиц нельзя рассматривать как липосомальные препараты, поскольку они не имеют характерной для липосом структуры мембранного пузырька (везикулы). Для создания кубосом наиболее широкое применение получили моноацилглицерины. Кубосомы можно использовать в качестве контейнеров для разнообразных веществ

[242-245].

К нелипосомальным суспензиям липидов следует отнести также твердые липидные наночастицы (SLN – solid lipid nanoparticles) ( Рис.3 е),

которые были изобретены в 1990-х годах и получили распространение в последнее время [246,247]. SLN представляют собой эмульсию липидных наночастиц, на поверхности которых могут находиться водорастворимые молекулы (сурфактанты, полимеры и др.), способствующие стабилизации эмульсии в воде и увеличивающие время циркуляции этих частиц в русле

47

крови. В отличие от липосом, твердые частицы имеют сплошное гидрофобное ядро, в состав которого могут входить природные липиды: моно-, ди- и триглицериды, или жирные спирты, кислоты или эфиры, что позволяет растворять внутри частиц различные жирорастворимые лекарственные вещества, включая агенты химиотерапии [248], биологически активные липиды [249] или гидрофобные пептиды и белки [250]. Эмульсии SLN нашли применение для пероральной доставки лекарств к органам гастроэнтеральной системы [251], а также для нанесения на поверхность кожи в косметике и дерматологии [252]. Позже они нашли применение также в парентеральной доставке лекарств [246,253]. Современные SLN могут длительное время циркулировать в русле крови и даже преодолевать гематоэнцефалический барьер, что позволяет использовать их для доставки лекарств в ткани мозга [254,255].

В настоящее время возможность использования липосом для доставки лекарственных веществ привлекает наибольшее внимание исследователей. Липосомам посвящено приблизительно столько же работ, сколько мицеллам, кубосомам, гексосомам, липидным или полимерным наночастицам и другим структурам вместе взятым. Известны пока немногочисленные примеры применения липосомальных препаратов в клинической практике, десятки препаратов проходят клинические испытания, еще большее количество находится на стадии доклинических исследований

[256-259].

2.2. Кубосомы и гексосомы в доставке веществ

Кубические фазы, прежде всего, биконтинуальные кубические фазы, а также гексагональная Н2 фаза представляют большой интерес в разнообразных областях, связанных с адсорбцией веществ, направленной доставкой и контролируемым высвобождением лекарств, получением кристаллов мембранных белков, проведением химических реакций на границах раздела фаз, синтезом материалов с контролируемым размером пор и т.д. Кубические и гексагональные мезофазы липидов потенциально можно использовать в медицине, фармакологии, косметике и пищевой промышленности. Эти фазы липидов соответствуют многим требованиям, предъявляемым системам доставки лекарственных веществ. Их характерными особенностями являются огромная площадь поверхности раздела гидрофобной и гидрофильной фаз в которых могут быть растворены различные вещества, включая лекарства, природные полимеры (полинуклеотиды, полипептиды, белки). Благодаря большой поверхности устанавливается равновесие для веществ, способных растворяться в обеих фазах в соответствии с коэффициентом распределения [260]. Это позволяет обес-

48

печить длительное контролируемое высвобождение как водорастворимых, так и липофильных веществ [242-245]. При этом сохранность веществ может существенно возрастать, поскольку липиды обеспечивают их защиту от неблагоприятного воздействия внешней среды [261-267], что было показано на примере защиты глюкозы от глюкозоксидазы [268], защиты цефазолина и цефуроксима от химической деградации и окисления [269], предотвращения агрегации и преципитации молекул инсулина

[270]

Рис.4. Молекулярная структура и обозначения четырех ненасыщенных моноацилглицеринов [52]:

14:1с9 мономеристолат глицерина 18:1с9 моноолеат глицерина, 18:1с11 моновакценат глицерина 22:1с13 моноеруцинат глицерина

Гидратированные моноацилглицерины (Рис.4) образуют наиболее хорошо изученные биконтинуальные кубические и гексагональную Н2 фазы. Представленные моноацилглицерины содержат двойную связь в cisконформации, которая может находиться в различных местах ацильной цепи. Двойная связь в цис-конформации способствует образованию изгиба ацильной цепочки, что приводит к увеличению объема гидрофобного хвоста по сравнению с насыщенными цепочками и способствует образованию инвертированных фаз. На представленных рисунках даны примечания, обычно используемые для обозначения ненасыщенных моноацилглицеринов. Например, в аббревиатуре наиболее известного моноолеата глицерина 18:1с9, первое число (18) обозначает длину ацильной цепи, тогда как 1с9 обозначает, что ацильная цепь имеет одну двойную связь в цис (cis) конформации рядом с девятым атомом углерода. Фазовое поведение указанных моноацилглицеринов исследуется многими лабораториями, среди которых наиболее систематические работы проводились в лаборатории Каффри [271-276].

На фазовых диаграммах цис-ненасыщенных моноацилглицеринов, отличающихся длиной углеводородной цепи и положением двойной связи (Рис.5), можно найти множество корреляций между молекулярной структурой и фазовым поведением этих липидов. Например, мономиристолеинат глицерина и моноолеат глицерина (Рис. 5 а, б) имеют идентичные полярные головы и двойные связи в обоих случаях располагаются в 9-том