3 курс / Фармакология / Интеллектуальные_липидные_наноконтейнеры_в_адресной_доставке_лекарственных

9

рыми важными свойствами природных липидов, химическое строение которых чрезвычайно разнообразно. Многие из этих соединений будут рассмотрены нами в дальнейшем в связи с их использованием при создании наноконтейнеров для лекарственных веществ. Для нас наибольший интерес представляют поверхностно активные вещества, называемые амфифилами, к числу которых принадлежат большинство природных липидов и их синтетических аналогов.

Амфифилами называют вещества, молекулы которых состоят из двух частей, поведение которых в двухфазной системе вода/масло (или вода/органический растворитель) существенно различается. Одна часть молекулы, называемая гидрофильной, экспонируется в воду, тогда как другая часть молекулы, гидрофобная, переходит в масло, или эквивалентный ему растворитель, как например, декан, изооктан и т.д. Поэтому в молекулах многих липидов, особенно фосфолипидов, одну часть молекулы называют полярной головой, а другую – гидрофобным хвостом, который обычно содержит длинную углеводородную цепь. Молекулы амфифилов плохо растворимы в воде, склонны к агрегации и образованию различных структур, среди которых хорошо известны мицеллы, мембранный бислой, кубические и гексагональные жидкие кристаллы. Эти структуры формируются спонтанно, поскольку амфифилы обладают уникальной способностью к «самосборке», имеющей огромное биологическое значение, и привлекающее внимание многих исследователей потенциальной возможностью практического использования. В образующихся при самосборке структурах, например в бислое, молекулы липида удерживаются в результате гидрофобного взаимодействия [34,35]. Характер упаковки молекул в липидном бислое зависит от параметров окружающей среды. Их изменение инициирует фазовые переходы.

1.1.2. Термотропные фазовые переходы липидного бислоя

С изменением температуры в липидном бислое может наблюдаться один или несколько фазовых переходов, которые называются термотропными. Характерным примером сложного фазового поведения бислойной структуры являются мембраны, образованные насыщенными фосфатидилхолинами, которые обнаруживают термотропные фазовые переходы из твердого в твердое или из твердого в жидкое состояния (Рис.1). Эти переходы обозначаются как предпереход (Tp) и главный фазовый переход (Tm), при котором происходит плавление липида.

Причина такого поведения кроется в том, что фосфатидилхолины имеют сравнительно большую полярную голову. Для компенсации избыточной площади полярной области бислоя по сравнению с площадью, образуемой углеводородными хвостами, молекулы вынуждены располагаться наклонно, под непрямым углом к плоскости мембраны. По мере

10

повышения температуры, соотношение площадей полярной и гидрофобной областей меняется, кроме того, меняется характер движения углеводородных хвостов, соответственно меняется и способ, посредством которого молекулы компенсируют стерическое (пространственное) несоответствие площадей полярной и гидрофобной областей, возникающее при упаковке в бислойную структуру [36].

Рис.1. Схема, показывающая изменения структурной организации бислоя насыщенных фасфатидилхолинов при различных температурах. Показана термограмма липосом из DMPC, полученная с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии, на которой видно изменение теплопоглощения липидов при температуре предперехода (Tp) и главного фазового перехода (плавления) липида (Tm). Показано схематическое изображение и электронные микрофотографии замороженных сколов фосфолипидного бислоя в состоянии геля (Lβ), структуры риппл (Pβ), а также в жид- ко-кристаллическом состоянии (Lα).

Особый интерес представляют структуры, так называемой, «риппл» фазы (Pβ), находящейся в температурном интервале между предпереходом (Tp) и главным фазовым переходом (Tm). Риппл фаза наблюдается в некоторых фосфатидилхолинах (DMPC, DPPC) и отличается специфической волнистостью бислоя с весьма строгим периодом, характерным для данного липида. Наличие такой периодичности и величина периода могут меняться под воздействием различных факторов, что является своеобразным ультраструктурным свидетельством произошедших изменений в бислое.

11

Плавление липидов, происходящее при температуре главного фазового перехода (Tm), имеет большое биологическое значение, поскольку при температуре ниже Tm функционирование мембранных белков затруднено, процессы жизнедеятельности затормаживаются и мембраны могут повреждаться, что приводит к увеличению проницаемости бислоя [37-39]. Наибольшие изменения проницаемости бислоя наблюдаются непосредственно в процессе плавления липидов при температуре Tm. Как будет обсуждаться в соответствующих главах книги, это явление находит практическое применение при создании термочувствительных липосом, способных высвобождать находящиеся в них вещества при изменении температуры.

1.1.3. Полиморфизм липидов

Хотя наиболее известной структурой, формируемой природными липидами, является бислой, составляющий основу биологических мембран, клетки содержат также большое количество липидов, которые, после их экстракции из мембран, образуют неламеллярные (небислойные) структуры при физиологических температурах [40-43]. Например, один из наиболее широко распространенных в клетках липидов, фосфатидилэтаноламин при физиологических температурах образует гексагональную НII фазу, а в некоторых условиях может образовывать также кубические фазы [41,44,45]. Многие гликолипиды также способны образовывать небислойные структуры [46]. Не только экстракты природных липидов, но даже искусственно созданные смеси липидов, имитирующие состав клеточных мембран, легко образуют небислойные структуры в физиологических условиях [47].

Образуемых амфифилами структуры следует рассматривать как отдельные фазы, поскольку они пространственно ограничены и характеризуются единообразием молекулярной упаковки и набором специфических физических свойств. Примечательно, что в молекулярной упаковке липидов присутствует дальний порядок в двух или трех измерениях, но при этом ближний порядок, а именно, точные координаты расположения атомов и молекул, отсутствуют вследствие молекулярной диффузии. Это позволяет рассматривать их как жидко-кристаллические структуры, называемые лиотропными мезофазами [42]. Термин «мезофазы» обозначает, что в процессе фазового перехода липидов происходит образование ряда промежуточных (мезоморфных) состояний, наблюдающихся при переходе между нематическими (линейными) и смектическими (слоистыми) фазами жидких кристаллов [40,48-51]. Перечисленные ниже лиотропные мезофазы (Табл.1) будут рассмотрены более подробно в следующих разделах.

12

Таблица 1. Некоторые лиотропные мезофазы и их обозначения

*Примечание: подстрочным индексом (I) обозначаются нормальные фазы (масло в воде), а индексом (II) – инвертированные фазы (вода в масле).

Фазовые переходы липидов сопровождаются формированием различных кристаллических форм, что послужило причиной названия этого типа фазовых переходов «полиморфизмом». Экспериментальные наблюдения позволяют определить наиболее типичные фазовые переходы, которые обычно наблюдаются при изменении температуры и степени гидратации липидов. Были сделаны попытки обнаружить некоторую последовательность смен фаз и выстроить лиотропный (зависящий от степени гидратации) ряд фазовых переходов, характерный для амфифилов (Рис. 2).

Рис.2. Идеализированная « натуральная» последовательность лиотропных мезофаз [42,52-55]. I – мицеллярные кубические фазы, Н – гексагональные трубчатые фазы, V – биконтинуальные кубические фазы, L – ламеллярные (смектические) фазы. Подстрочные индексы (I) и (II) обозначают структуры первого или второго типа.

Представленный ряд симметричен относительно центра, в котором находится ламеллярная фаза L. Существует большое разнообразие ламеллярных фаз, но для полиморфных фазовых переходов обычно требуется расплавленный липид и, соответственно, в рассматриваемой схеме подразумевается жидкокристаллическая Lα фаза. Вправо и влево от нее следуют кубическая биконтинуальная, трубчатая гексагональная и кубическая мицеллярная фазы, которые будут рассмотрены ниже более подробно. При этом слева от ламеллярной фазы представлены, так называемые, «обычные» структуры (тип I), а справа – инвертированные структуры (тип II). В обычных структурах полярные головы молекул обращены на поверхность частиц, тогда как внутрь обращены гидрофобные углеводородные цепи, что характерно для структур, образующихся в избытке воды

13

и высокой степени гидратации полярных голов. В инвертированных структурах, наоборот, на поверхность обращены гидрофобные части молекул, что может наблюдаться при недостатке гидратационной воды. Биологические среды, для которых характерно избыточное содержание воды, на первый взгляд, представляются неблагоприятными для формирования инвертированных структур, однако, как будет показано далее, их появление определяется не только общим содержанием воды в образце, но и формой молекул амфифилов, которая лишь отчасти связана с размером гидратной оболочки, окружающей полярные головы молекул. Было обнаружено, что инвертированные структуры играют важную роль в жизнедеятельности клетки. Они также используются при создании «интеллектуальных» липосом, обладающих способностью высвобождать лекарственные вещества или нуклеиновые кислоты в ответ на химические или физические сигналы.

1.1.4. Молекулярные основы полиморфизма

Идея корреляции между формой молекул и фазовым поведением липидов впервые была высказана более 30 лет назад [56-58]. Вместе с теорией внутренней кривизны липидного слоя [51,59] эта идея стала теоретической основой объяснения структурного полиморфизма липидов и механизма переходов из ламеллярной в неламеллярные кубические и гексагональные фазы липидов [60,61]. Существует два теоретических подхода в объяснении молекулярных основ фазового поведения липидов, определяющего формирование бислойных и различных небислойных структур. Один подход основан на оценке усредненной «вероятностной» формы молекул липидов [56,62,63], другой подход развивает представления о существовании внутренней спонтанной кривизны монослоя липидов, который, в конечном счете, определяет их фазовое поведение [59,6468].

Предполагается, что липид с цилиндрической формой молекул может образовывать плоские или слабо изогнутые структуры, присутствующие в большинстве биологических мембран и в крупных липосомах. Внутренняя кривизна этих мембран невелика. Однако не все молекулы липидов способны образовывать плоские структуры. Если полярная голова очень велика по сравнению с неполярной частью, молекула липида имеет коническую форму. Если полярная голова сравнительно мала, молекула имеет форму обратного конуса. Молекулы конической формы, или формы обратного конуса не способны образовывать плоские бислои и образуют различные неламеллярные структуры с высокой внутренней кривизной [69].

14

Эти подходы не противоречат, а скорее дополняют друг-друга. Подход, основанный на оценке формы молекулы, учитывает такие параметры, как размер гидратной оболочки, силы Ван-дер-Ваальса, наличие водородных связей и заряженных групп при определении стерических параметров взаимодействия между молекулами. На основе этих параметров определяется площадь поперечного сечения полярных голов (ао), длина (lc) и объем углеводородных цепочек (v). Далее предполагается, что эти геометрические свойства липидных молекул определяют так называемый параметр упаковки P на основании которого можно делать предсказания о «предпочтительной» форме молекул липида:

Р=v / аоlc

Липиды с цилиндрической формой молекул характеризуются величиной параметра упаковки Р = 1 и склонны образовывать плоские бислойные структуры (Рис.3).

Рис. 3. Соотношение между формой молекулы липидов и структурой, образуемых ими фаз.

А – молекулы клиновидной формы (формы перевернутого конуса) образуют нормальные мицеллярные структуры сферической или цилиндрической формы (P < 1/2 – 1/3)

Б – молекулы цилиндрической формы образуют плоские или изогнутые бислойные структуры

(P = 1)

В – молекулы конической формы образуют инвертированные мицеллярные структуры сферической или цилиндрической формы (P > 1)

Стопки плоских или имеющих малую кривизну бислоев образуют структуру жидких кристаллов называемых смектической фазой. Смектические фазы образуются многими природными фосфолипидами, входящими в состав клеточных мембран и липосом. При величинах Р > 1 молекулы имеют коническую форму и образуют инвертированные структуры, которые относят к типу II. При величинах Р < 1/2 – 1/3, молекулы имеют форму перевернутого конуса (клина), что характерно для сурфактантов,

15

обладающих способностью образовывать «нормальные» мицеллы, относящиеся к типу I. Такие вещества называют детергентами. Они могут разрушать ламеллярные структуры и переводить в растворимое состояние (суспензию мицелл) многие гидрофобные молекулы.

Несмотря на простоту, эта модель оказалась очень удобной при объяснении поведения разнообразных липидных систем, хотя она не обладает большой предсказательной силой. Критики этого подхода указывают на то, что при температуре выше точки главного фазового перехода (t > Tm) молекулы липидов не имеют определенной формы, и их поведение не может быть описано простыми параметрами упаковки [66].

Альтернативный подход в описании фазовых переходов из бислоя в небислойные структуры основан на анализе баланса между величинами свободной энергии упаковки и изгиба монослоев липида [64]. При этом учитываются силы, возникающие из взаимодействий, как в полярных, так и в гидрофобных областях липида. При изгибах слоев возникают эластические напряжения, которые могут быть описаны в терминах свободной энергии (∆E):

∆E = k(1/R – 1/R o)2

k – модуль изгиба (коэффициент упругости)

R – радиус кривизны в области интерфазы вода-липид (имеет положительный знак для инвертированных фаз)

Ro– внутренний радиус кривизны монослоя (∆E = 0, если R = Ro)

В представленной выше формуле модуль изгиба k характеризует сопротивление монослоя липида к изгибу. Предполагается, что монослой липида обладает внутренней (т.е. присущей данному образцу) кривизной с радиусом Ro , которая определяется путем вычислений с учетом физических свойств липидов. Если радиус фактически измеряемой кривизны монослоя R отличается от Ro, возникает напряжение, определяемое величиной свободной энергии ∆E. Возникающие в слоях липида напряжения приводят к их дестабилизации и может служить причиной фазовых переходов из бислоя в небислойные структуры в условиях, когда эти напряжения превышают энергетическую цену трансформации.

1.1.5. Нормальные фазы

Нормальными называются фазы в которых полярные головы липидов обращены на внешнюю поверхность частиц и, следовательно, экспонированы в воду. Нормальные структуры относят к первому типу (тип I). При величине Р близком к единице такими структурами являются бислои и образуемые бислоями смектические фазы – стопки бислойных структур

(Рис.4 А).

16

Рис.4. Лиотропные фазовые переходы от ламеллярных структур к нормальным мицеллам различной формы, образуемым молекулами с формой перевернутого конуса (клиновидной формы). А – показаны мембранные везикулы (липосомы), образованные бислоем липидов. При рассмотрении фрагмента липосомы можно видеть стопку бислойных структур, которая представляет собой смектическую фазу. Б – при появлении в составе липосом некоторого количества липидов клиновидной формы происходит разрушение бислойной структуры и образование нормальных мицелл. На рисунке сверху вниз (а – г) показаны мицеллы и образуемые ими фазы в порядке возрастания кривизны монослоя, т.е. уменьшения величины параметра упаковки Р.

При уменьшении параметра Р, характерном для молекул липидов клиновидной формы (формы перевернутого конуса), происходит разрушение бислойной структуры (Рис.4 Б). Так, при величинах Р < 1/2 - 1/3 [56,62,63] происходит фрагментация бислойных структур и появление нормальных мицелл, имеющих форму дисков, трубочек или сфер (Рис.4 Б, а - г). При высокой концентрации липида или высокой ионной силе раствора частицы могут агрегировать и образовывать соответственно стопки плоских мицелл (смектическая фаза), пучки цилиндрических мицелл (гексагональная НI фаза), или кристаллические структуры из сферических мицелл (мицеллярные кубические фазы, тип I ).

17

К числу веществ, вызывающих фрагментацию бислоя (Рис.5), относятся, например, фосфолипиды с одной углеводородной цепью (лизофосфолипиды), фосфолипиды с малой длиной цепей (С10 и меньше), а также такие классические детергенты, как додецилсульфат натрия, тритон Х100, холиевые кислоты и др. [70-75].

Рис.5. Некоторые, наиболее часто используемые детергенты. CTAB – цетилтриметиламмоний бромид, SDS – додецил сульфат натрия (sodium dodecyl sulfate), LDAO

– лаурил-диметиламинооксид (lauryl-dimethylamineoxide), CHAPS – 3-[(3- Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate. Необходимо обратить внима-

ние, что Тритон Х-100 и β-октилгликозид относятся к неионным детергентам, поскольку не имеют заряженных групп. Холиевая кислота и SDS принадлежат к анионным детергентам, несущим отрицательный заряд в нейтральных средах. CTABr – принадлежит к катионным детергентам, имеющим положительный заряд, тогда как LDAO и CHAPS – к цвиттерионным детергентам, поскольку несут, как положительный, так и отрицательный заряды.

Указанная выше последовательность событий (Рис.4) наблюдается при действии детергентов на фосфолипидный бислой липосом или мембран клеток. При взаимодействии детергентов с бислоем его барьерные свойства нарушаются вследствие образования отверстий в бислое или «пор» [76,77]. При дальнейшем увеличении концентрации детергентов происходит фрагментация бислоя и образованию мицелл. При этом наблюдается следующая последовательность структурных изменений при действии возрастающих концентраций детергентов, например, при действии желчных кислот на мембраны из лецитина [78]: везикулы диски трубочки сферы. Аналогичная зависимость от концентрации была получена также при действии детергента цетилтриметиламмоний бромида

18

(CTAB) на бислой из перфтороктаноата натрия [79]. Предполагается, что в порах, а также на краях дисков преобладают липиды с формой перевернутого конуса (клина), тогда как в остальной, плоской части этих структур находятся липиды цилиндрической формы. По мере увеличения концентрации клиновидных липидов доля плоских поверхностей уменьшается, что приводит к окончательному исчезновению плоских структур и появлению сначала трубочек, где вдоль длинной оси продолжает сохраняться значение параметра кривизны Р, близкое к единице, как в плоских структурах, а потом – сферических структур с низкими значениями Р по всем направлениям.

Однако не следует считать, что мицеллы обязательно имеют правильную форму. Молекулярное моделирование позволяет предположить, что липиды в мицеллах могут быть организованы достаточно хаотически

(Рис.6).

Рис.6. Различные формы мицелл. Молекулярная модель мицелл β- октилгликозида в воде [70], состоящая из 20 молекул (а) и из 50 молекул (б). А также схематическое изображение (в) и молекулярные модели структур гамбургера (г) и червеобразных мицелл (д), образованных триблок-сополимером OEF [80]. Темные кружки соответствуют атомам кислорода и представляют гидрофильные части молекул, а светлые кружки – атомам углерода, что соответствует гидрофобным частям молекул. Как следует из представленных моделей, в мицеллах упорядоченность молекул невысока. Кроме того, полярные головы сурфактантов не способны покрыть всю поверхность мицелл и поэтому гидрофобные части молекул оказываются экспонированными в водное окружение.

Кроме того, полярные головы не способны полностью экранировать углеводородные части молекул от взаимодействия с водой, что приводит к экспонированию в воду гидрофобных структур. Поскольку детергенты часто используются для солюбилизации биологических мембран, в состав мицелл могут входить молекулы белков, что придает мицеллам еще более сложную форму [70].

Процесс образования мицелл является общим свойством, характерным для различных сурфактантов, к числу которых могут относиться как сравнительно набольшие молекулы липидов, так и полимерные молекулы, состоящие из гидрофильных и гидрофобных блоков (блоксополимеры). Характерной особенностью небольших молекул является